Główny

Kropki kwantowe mają kilka korzystnych cech, które uczyniły je fluoroforem z wyboru w wielu zastosowaniach. Niestety nie są one szczególnie odpowiednie do obrazowania in vivo całych zwierząt, aplikacji, która staje się coraz bardziej popularna. Teraz Jianghong Rao, Sanjiv Gambhir i koledzy z Molecular Imaging and Bio-X Program do interdyscyplinarnych badań w Stanford opisują syntezę i wykorzystanie bioluminescencyjnych kropek kwantowych do obrazowania in vivo.

Chociaż kropki kwantowe mogą emitować światło w czerwonych i podczerwonych obszarach widma, które mają dobrą penetrację tkanek, wszystkie wymagają niebieskiego światła do skutecznego wzbudzenia. Niebieskie światło nie przenika jednak dobrze do tkanek, a także wytwarza wysokie tło z powodu wzbudzenia endogennych fluoroforów. Podczas obrazowania in vivo skutkuje to niską wydajnością wzbudzenia i wysokim tłem. Rao i współpracownicy pomyśleli, że musi istnieć sposób na rozwiązanie tego problemu.

Rao mówi, że postanowili spróbować użyć światła luminescencyjnego do wzbudzenia kropek kwantowych. Światło to może pochodzić z bioluminescencyjnego białka, które wytwarza światło poprzez reakcję chemiczną. "Najpierw spróbowaliśmy lucyferazy świetlika i bardzo trudno było zrobić koniugację" - mówi Rao. "Powodem było prawdopodobnie to, że lucyferazy świetlika jest bardzo delikatna i wrażliwa na wszelkie modyfikacje chemiczne. To spowodowało, że dramatycznie stracił swoją aktywność lucyferazy. "

Laboratorium Gambhir opracowało metody wykorzystania obrazowania BRET u żywych myszy, a także opracowało wariant Renilla reniformis luciferase (Luc8), który wykazał większą stabilność i lepszą wydajność w porównaniu z innymi lucyferazy. Ponadto Luc8 emituje światło o krótszej długości fali niż lucyferazy świetlika, która lepiej pokrywa się z widmem absorpcyjnym kropek kwantowych, a jej aktywność nie jest zależna od wykorzystania ATP. Rao próbował użyć tego nowego wariantu Luc8 i zadziałało. Mówi: "Piękno tego Luc8 polega na tym, że jest bardzo tolerancyjny na modyfikacje chemiczne, a to bardzo ułatwia koniugację i zachowanie aktywności lucyferazy".

Wyrażono obawy dotyczące zdolności kropek kwantowych do działania jako akceptory transferu energii rezonansu fluorescencyjnego dla fluoroforów organicznych. Po przetestowaniu zarówno niekowalencyjnych, jak i kowalencyjnych metod sprzężenia Luc8 z kropkami kwantowymi, Rao odkrył jednak, że koniugacja kowalencyjna pozwala na bardzo wydajny transfer energii bioluminescencji z Luc8 do kropki kwantowej (ryc. 1).

Rysunek 1: Schemat przedstawiający konstrukcję i funkcję bioluminescencyjnej kropki kwantowej.
rysunek 1

Utlenianie celenterazyny przez Luc8 sprzężone z kropką kwantową uwalnia energię bioluminescencji. Część tej energii wzbudza kropkę kwantową, powodując uwolnienie czerwonego światła. Przedruk za zgodą Nature Biotechnology.

Obraz w pełnym rozmiarze

Po wstrzyknięciu myszom te bioluminescencyjne koniugaty kropek kwantowych wytwarzały dobre sygnały bez tła po wstrzyknięciu substratu lucyferazy koelenterazyny do krwioobiegu. Co więcej, Rao i współpracownicy byli w stanie wykorzystać fakt, że kropki kwantowe o różnych widmach emisyjnych mają podobne profile absorpcji, dzięki czemu wszystkie z nich mogą funkcjonować jako akceptory energii lucyferazy. Kropki kwantowe o szczytach emisji od 605 nm do 800 nm działały dobrze i umożliwiały multipleksową detekcję sygnałów in vivo.

Właściwości tych koniugatów powinny sprawić, że będą one odpowiednie do stosowania u zwierząt większych niż myszy, a Rao mówi, że testują te koniugaty do wykorzystania do funkcjonalnego obrazowania in vivo. Gambhir mówi, że te sondy pozwolą na multipleksowanie, dzięki czemu wiele zdarzeń może być monitorowanych w tym samym żywym obiekcie. Badają również sposoby wykorzystania modulacji sygnału BRET do wykrywania funkcji enzymu lub białka.