Abstrakt
Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej typu 2 (SARS-CoV-2), który powoduje chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19), stanowi wiele wyzwań dla zdrowia na świecie. Szczepionki, w tym mRNA nanocząstek na bazie lipidów, inaktywowany wirus i rekombinowane białko, były stosowane w celu zapobiegania zakażeniom SARS-CoV-2 w klinikach i są niezwykle pomocne w walce z epidemią. Tutaj najpierw prezentujemy doustną szczepionkę mRNA opartą na egzosomach pochodzących z mleka bydlęcego (mleko-egzo), która koduje domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2 (RBD) jako immunogen. Wyniki wskazują, że mRNA RBD dostarczane przez egzosomy pochodzące z mleka mogą wytwarzać wydzielany peptyd RBD w 293 komórkach in vitro i stymulować przeciwciała neutralizujące przeciwko RBD u myszy. Wyniki te wskazują, że szczepionka mRNA oparta na egzosomach pochodzącym z mleka bydlęcego może służyć jako nowa strategia zapobiegania zakażeniu SARS-CoV-2. Tymczasem może również działać jako nowy doustny system dostarczania mRNA.
Jednozdaniowe podsumowanie Doustna szczepionka mRNA SARS-CoV-2 oparta na egzosomach pochodzących z mleka bydlęcego może stymulować przeciwciała neutralizujące u myszy.
Wprowadzenie
COVID-19 zazwyczaj wykazuje objawy wspólne dla wielu infekcji dróg oddechowych, w tym gorączki i kaszlu. Mimo to w wielu przypadkach przechodzi w cięższą chorobę, która może obejmować ostrą niewydolność oddechową, rozsianą chorobę i śmierć (1-3). Białko Spike SARS-CoV-2 jest homotrimeryczną glikoproteiną transbłonową złożoną z podjednostek S1 i S2. Kiedy białko spike oddziałuje ze specyficznymi receptorami na komórkach gospodarza, jego domena wiążąca receptor (RBD) znajduje się na końcu C S1 i może specyficznie wiązać się z receptorem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) i inicjuje fuzję błony między wirusem a komórką gospodarza (4-7). Badania wykazały, że RBD jest głównym celem większości neutralizującej aktywności w surowicy odpornościowej, co sugeruje, że RBD może być potencjalnym celem szczepionki lub terapii 2019-nCoV (8-10).
Obecnie dostępne platformy dla szczepionek COVID-19 obejmują szczepionki inaktywowane, żywe atenuowane szczepionki, rekombinowane szczepionki białkowe, szczepionki wektorowe wirusowe i szczepionki kwasów nukleinowych (11). W 2021 r. przychody ze szczepionek COVID-19 kluczowych globalnych przedsiębiorstw wykazały, że przychody mRNA firm Pfizer i niemieckiego BioNTechnology wyniosły odpowiednio 367,8 mld dolarów i 213,6 mld dolarów, co stanowi ponad połowę udziału w światowym rynku szczepionek. Szczepionka mRNA firmy Pfizer stanowiła najwyższy odsetek, ponieważ szybko przyciągnęła dużą uwagę i promocję ze względu na jej bezpieczeństwo, wysoką wydajność i krótkie cykle produkcyjne. W porównaniu z innymi platformami technologii szczepionek, platforma szczepionek mRNA ma również te zalety, w tym 1. doskonały efekt immunologiczny; 2. krótki cykl badawczo-rozwojowy; 3. dogodna produkcja na dużą skalę (12, 13); 4. brak ryzyka zakażenia lub integracji genomu (14-16); 5. ludzki system ekspresji wyraża antygeny z dobrym odzyskiem immunogennym (17); 6 stymulacja odporności humoralnej i komórkowej (18, 19); 7. Bez adiuwantu i tak dalej. Jednak szczepionki mRNA są również wadliwe, z wysokimi barierami technicznymi i ograniczeniami patentowymi technologii dostarczania; Są niestabilne i niewygodne w konserwacji i transporcie. Tradycyjnie wymaga zastrzyku domięśniowego i profesjonalnej operacji.
Większość szczepionek poddawanych obecnie badaniom klinicznym wstrzykuje się domięśniowo lub podskórnie, ograniczając aktywację immunologiczną do kilku drenujących węzłów chłonnych (20, 21). Uważa się, że podawanie doustne ma wyższy profil bezpieczeństwa, lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjenta i niższe koszty leczenia niż wstrzyknięcie (20, 22). Trudności złożonego środowiska żołądkowo-jelitowego i bariery nabłonkowe jelit ograniczyły stosowanie szczepionek doustnych. Aby wchodzić w interakcje z obfitymi komórkami odpornościowymi w blaszce prima, idealna szczepionka doustna musi tolerować środowisko żołądkowo-jelitowe i pokonywać bariery nabłonkowe jelit (23).
Exosomy to pochodzące z komórek, błoniaste pęcherzyki obecne w prawie wszystkich płynach ustrojowych. Przy rozmiarach o średnicy od 35 do 120 nm egzosomy składają się z dwuwarstwy fosfolipidowej pochodzącej z błony komórki pochodzenia. Ostatnio zwrócił na siebie uwagę ze względu na swoją naturalną rolę w przenoszeniu ładunków molekularnych (np. DNA, małych RNA, białek i lipidów) między odległymi komórkami w ciele. Potwierdzono, że mleko bydlęce jest bogate w egzosomy i wykazuje podobny potencjał, aby służyć jako nanonośniki leków (24). Mleko jest bardziej przystępnym cenowo i dostępnym źródłem w porównaniu z pożywkami do hodowli komórkowych. Ponadto mleko-egzos może zapewnić dodatkowe korzyści jako naturalnie pożądane nośniki doustne, co wskazuje, że mleko-egzos stanowią wygodniejszą i bardziej przyjazną dla pacjenta metodę terapeutyczną (25). Biorąc pod uwagę właściwości biologiczne egzosomów mleka i pokonując wyzwania technologiczne szczepionek mRNA, obecnie opisaliśmy metodę tworzenia egzosomów mleka obciążonych mRNA RBD, oceniliśmy ich skuteczność w dostarczaniu funkcjonalnego mRNA, opracowaliśmy nowatorską platformę technologii szczepionek doustnych opartą na egzosomach mleka i zbadaliśmy wstępną skuteczność nowej doustnej szczepionki opartej na egzosomach mleka u myszy w celu wywołania odporności humoralnej na skok SARS-CoV-2 białka.
Wyniki
Otrzymywanie egzosomów pochodzących z mleka bydlęcego
Aby ocenić nasze metody przygotowania, egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego (mleko-egzo) zostały wyizolowane i oczyszczone za pomocą ultrawirowania gradientu gęstości (DC) (ryc. 1A). Sześć składników zostało zebranych przez DC, wśród których F1 wynosił około 5 ml, a F2 do F6 wszystkie 7 ml (ryc. 1B). Aby scharakteryzować izolowane mleko-egzo-egzo, biomarkery (CD9, TGS110) i morfologię wykorzystano do określenia egzosomów zawierających frakcję. Exosomy koncentrowały się głównie w F3 i F4 (ryc. 1C, D). Morfologia wykazała bogatą obfitość mieszanych populacji egzosomów z przeważnie nienaruszonymi pęcherzykami zgodnymi z klasyczną morfologią egzosomów i typową strukturą podobną do miseczki (ryc. 1D). Egzosomy mleka są charakterystyczne dla egzosomów o średnicy 30-150 nm obserwowano w sacharozie 0,95 mol/L-1,30 mol/l. Ponieważ frakcje 3 i 4 zostały wzbogacone w egzosomy, zostały połączone razem do dalszej analizy.
(A) Schematyczne przedstawienie głównych etapów izolowania egzosomów z surowego mleka bydlęcego. (B) F1–F6 oznacza odpowiednie stężenia sacharozy. (C) Zawiesina egzosomu została przeanalizowana przez western blot. Immunoblots wykazały marker egzosomów w różnych frakcjach egzosomu mleka. +, kontrola pozytywna (białko komórek HaCat); -, kontrola negatywna (białko komórek Hela). (D) Morfologia różnych frakcji uzyskanych przez TEM. (Podziałki = 500 nm).
Oczyszczanie i charakterystyka egzosomów pochodzących z mleka bydlęcego za pomocą ultrawirowania gradientu gęstości
Morfologia zbiorczej frakcji egzosomów wykazała bogatą obfitość egzosomów zgodną z klasyczną morfologią egzosomu (ryc. 2A), rozkładem wielkości (ryc. 2B) i markerami białkowymi (ryc. 2C). Trójkierunkowy diagram białek Venna ujawnił 1022 białka wspólne dla wszystkich zestawów danych, a 961 białek zostało powszechnie zidentyfikowanych we wszystkich trzech DC-mleko-egzo, jak pokazano na rycinie 2C. Analiza proteomiczna próbek wykazała, że lizaty białek egzosomów zostały przygotowane i zweryfikowane za pomocą analizy skupień dla ważnych egzosomalnych markerów błonowych CD9, CD63, CD81 i TSG101. Brak markerów powierzchniowych mikropęcherzyków GM130 i kaleksyny, a także brak markera retikulum endoplazmatycznego (ER) kaleksyny, potwierdził, że izolowane mleko-egzoskopy nie były zanieczyszczone innymi ciałami wielopęcherzykowymi (ryc. 2C). Przeanalizowano trzy partie egzosomów pochodzących z mleka bydlęcego uzyskanych przez ultrawirowanie gradientem gęstości (DC-mleko-egzo) i wskazano, że nie ma różnic między wieloma partiami DC-mleko-egzo.
(A) Morfologia i (B) analiza wielkości cząstek zostały wykryte odpowiednio za pomocą TEM i nanoFCM. (C) Trójkierunkowy diagram Venna białek z trzech partii DC-mleko-egzo-ujawnił 1022 białka wspólne dla wszystkich zestawów danych. Analiza skupień dla ważnych markerów błony egzosomalnej CD9, CD63, CD81, TSG101, markerów powierzchniowych mikropęcherzyków GM130 i markera retikulum endoplazmatycznego (ER) kaleksyny są wskazane w tabeli. Skróty: TEM, transmisyjny mikroskop elektronowy; DC-mleko-egzo, egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego poprzez ultrawirowanie gradientu gęstości. Podziałki = 500 nm.
Ładowanie egzosomów mRNA mRNA RBD pochodzących z mleka
Aby ustalić, czy DC-mleko-egzos może być obciążone egzogennymi, syntetyzowanymi in vitro mRNA, zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy mRNA domeny wiążącej receptor testowy (RBD) kodujący immunogenne formy skoku SARS-CoV-2. Region sekwencji kodującej RBD (CDS) ma długość 675 par zasad (bp) i znacznik FLAG. Badanie zsyntetyzowanego in vitro mRNA RBD za pomocą bioanalizatora (Agilent) potwierdziło, że próbka mRNA RBD przebiegała jako pojedyncze pasmo 1100 bps (ryc. 3A), zgodne z wielkością, którą spodziewaliśmy się zaprojektować transkrypcję in vitro. Aby ocenić jego funkcjonalność, mRNA RBD transfekowano do komórek 293T, a ekspresję peptydu RBD badano następnego dnia za pomocą western blot (ryc. 3B). Wyniki te wskazują, że mRNA RBD był syntetyzowany zgodnie z transkrypcją in vitro (IVT) i miał funkcję translacyjną, która może być tłumaczona na białko RBD w komórkach.
(A) Żelowy obraz zsyntetyzowanego w warunkach in vitro mRNA RBD przesłuchiwanego przy użyciu chipa RNA na bioanalizatorze Agilent. Dane dla markerów RNA, mRNA RBD, są prezentowane od lewej do prawej. (B) Western blot dla ekspresji białka RBD SARS-CoV-2 w limfocytach 293T, gdy mRNA RBD transfekowano do komórek 293T z dodatkowymi 24 godzinami leczenia wraz z 1 μg i 3 μg mRNA RBD. Pasy 1-3: kontrola; Pasy 4-6: 1 μg RBD-293T; Pasy 7-9: 3 μg RBD-293T.
Aby załadować mRNA IVT RBD do mleka DC, najpierw zmieszaliśmy go z lipidami kationowymi (DOTAP) w celu wytworzenia lipidów lipidowych. Następnie załadowaliśmy lipid-mRNA do DC-mleko-egzos poprzez podział indukowany mieszaniem (ryc. 4A). Oba procesy są napędzane przez siłę przyciągania ładunku, co powoduje enkapsulację lipidów-mRNA w błonach Milk-exos. Aby scharakteryzować biofizycznie mRNA mleka RBD, przeprowadzono morfologię i rozkład wielkości oraz analizę potencjału zeta (ryc. 4B-D). Aby określić wydajność ładowania tego procesu, zbadano produkty trzech niezależnych reakcji ładowania mRNA. Test ilościowy PCR w czasie rzeczywistym oparty na TaqMan wykazał, że wydajność obciążenia osiągnęła 57,3% (ryc. 4E).
(A) Schemat blokowy przygotowania szczepionki przeciwko SARS-CoV-2. Przeprowadzono morfologię (B), rozkład wielkości cząstek (C), analizę potencjału zeta (D) i wydajność ładowania mRNA RBD (E). Podziałki = 500 nm.
Weryfikacja szczepionek doustnych dla RBD mRNA-DC-mleko-egzo, in vitro i in vivo
Następnie przetestowaliśmy, czy Milk-exos załadowane mRNA RBD może dostarczyć funkcjonalne mRNA RBD do ludzkich komórek. Wyniki Western blot i ELISA wykazały, że Milk-exos obciążony mRNA RBD może dostarczać mRNA do 293 komórek i wytwarzać peptyd RBD 24 godziny później. (rys. 5A, B, p<0.01).
(A) Analiza Western blot ekspresji mRNA RBD dostarczanego przez szczepionkę doustną w limfocytach 293T. (B) Wykrycie metodą ELISA RBD wyrażonego w lizacie lizatu limfocytów 293T i wydzielanego do supernatantu hodowlanego w 24 h po transfekcji szczepionki opartej na egzosomie pochodzącym z mleka. Dane są prezentowane jako średnie odchylenie standardowe dla grupy o wielkości trzy. **P < 0,01 w porównaniu z PBS.
Aby dodatkowo potwierdzić zdolność do stymulowania przeciwciał neutralizujących, wstrzyknięto mRNA-mleko-egzos RBD do dwunastnicy (i. d.) 9-11-tygodniowych samic myszy BALB / c (ryc. 6A). Krew (0,1 ml) zbierano w dniach 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 w celu wykrycia przeciwciał przed uśmierceniem zwierząt. Korzystając z zestawów ELISA przystosowanych do wykrywania przeciwciał pochodzących od myszy, zaobserwowaliśmy, że zaszczepione zwierzęta wytwarzały stosunkowo stały poziom przeciwciał neutralizujących przeciwko RBD po drugim wstrzyknięciu (ryc. 6B, C).
(A) Immunizacja myszy i harmonogram pobierania próbek surowic. Myszy BALB / c otrzymały te same dawki doustnej szczepionki dla egzosomów mlecznych opartych na SARS-CoV-2 (N = 5) lub soli fizjologicznej (N = 3) w dniu 0 i zostały ponownie wzmocnione w dniach 14 i 35. Surowice pobierano w dniach 0 (przed szczepieniem), 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49 (po szczepieniu). Niebieska i czerwona strzałka reprezentowały odpowiednio punkty czasowe immunizacji i pobrania krwi. (B) Przeciwciała neutralizujące szczepionki doustnej dla egzosomów mlecznych opartych na SARS-CoV-2 w surowicy oznaczano metodą ELISA. Czerwona przerywana linia reprezentowała wartość graniczną przeciwciał neutralizujących przeciwko peptydowi RBD. N = 3 (kontrola), N = 5 (RBD-DC-mleko-egzo), a dane przedstawiono jako średnią±STD. **P < 0,01, ***P < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną.
Dyskusja
W tym badaniu wykazaliśmy, że doustna szczepionka dla egzosomów pochodzących z mleka bydlęcego opartego na SARS-CoV-2 może dostarczać funkcjonalnego mRNA in vitro i in vivo oraz indukować odpowiedzi przeciwciał anty-S. Najpierw z powodzeniem zweryfikowaliśmy techniczną wykonalność doustnego dostarczania mRNA w oparciu o egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego jako nośniki dostarczające.
W porównaniu z wstrzyknięciem, podawanie doustne ogólnie uznano za mające lepszy profil bezpieczeństwa, lepsze przestrzeganie zaleceń przez pacjenta i niższe koszty leczenia (20, 22). Podobnie jak liposomy, egzosomy mają błonę bilipidową i wodny rdzeń; Dlatego mogą być potencjalnie obciążone lekami hydrofilowymi i lipofilowymi (26). Jednak praktyczne zastosowanie terapii opartych na egzosomach w transformacji klinicznej pozostało ciągłym wyzwaniem. Wiele badań wyizolowało egzosomy z pożywek hodowli komórkowych o niskiej wydajności i kosztach, co utrudniało zwiększenie produkcji (27). Opłacalne i skalowalne źródło powinno być zoptymalizowane w oparciu o obecne ograniczenia.
Doniesiono, że egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego wykazywały podobny potencjał, aby służyć jako nanonośniki dostarczające leki (24). Mleko było bardziej przystępnym cenowo i dostępnym źródłem w porównaniu z pożywkami do hodowli komórkowych. Ponadto egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego mogą zapewniać dodatkowe korzyści jako naturalnie pożądane doustne nośniki dostarczania, co wskazuje, że egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego stanowią wygodniejszą i bardziej przyjazną dla pacjenta metodę terapeutyczną (25).
W niniejszym dokumencie zaprezentowaliśmy szczepionkę doustną, która różniła się od poprzednich technologii doustnego dostarczania szczepionek opartych na nanomateriałach tym, że zawierała egzosomy pochodzące z mleka bydlęcego, a doustna szczepionka mRNA COVID-19 pochodząca z mleka uzyskana z egzosomów miała swoją technologię dostarczania i zdolność do industrializacji. Chociaż wyniki tego badania sugerowały korzystne działanie szczepionki doustnej w zapobieganiu nowemu koronawirusowi i oferowały potencjalny schemat do zastosowania klinicznego, musieliśmy zwiększyć liczbę zwierząt i dalej weryfikować skuteczność szczepionki doustnej w różnych modelach zwierzęcych (takich jak duże zwierzęta) w przyszłych badaniach. Ponadto konieczne było dalsze zbadanie dokładnych mechanizmów molekularnych i bezpieczeństwa.
Chociaż ultrawirowanie gradientu gęstości jest złotym standardem izolacji i oczyszczania egzosomów, przeprowadzono kilka badań nad ekstrakcją egzosomów z mleka krowiego przy użyciu samych technik wirowania różnicowego (28, 29) lub strącania (30, 31). W połączeniu z wirowaniem różnicowym zastosowaliśmy metody ultrawirowania gradientu gęstości, aby wyizolować egzosomy z mleka, które były zasadniczo wolne od zanieczyszczeń mikropęcherzykami. Końcowa czystość próbki może osiągnąć 100%. Natomiast technika zastosowana w tym badaniu do oczyszczania egzosomów jest niekompatybilna z produkcją egzosomów na dużą skalę, co jest jedną z przeszkód w postępie industrializacji. Dobrą wiadomością jest to, że ustanowiliśmy oparty na chromatografii nowatorski proces produkcyjny w celu oczyszczenia egzosomów z mleka bydlęcego o lepszej jakości niż produkcja przez DC (dane nie są pokazane).
Wkrótce system dostarczania mRNA oparty na egzosomach pochodzących z mleka będzie służył jako platforma do rozwoju terapii mRNA w niedalekiej przyszłości.
Materiały i metody
Linie komórkowe i hodowla komórkowa
Limfocyty 293T (SCSP-502) (ludzkie embrionalne komórki nabłonkowe nerki) zostały zakupione od Banku Komórek Komitetu Ochrony Kultury Typowej Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny). Komórki 293T hodowano w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem penicyliny / paciorkowca w temperaturze 37 ° C i 5% stężeniem CO2 w nawilżonej atmosferze. Połączone komórki utrzymywano w DMEM zawierającym 10% (vol / vol) FBS, zmieniając pożywkę co drugi dzień. Gdy zbieg hodowanych komórek osiągnął 80%, odłączono je przez potraktowanie 0,25% (wt/vol) trypsyną i 0,1% (wt/vol) kwasem etylenodiaminotetraoctowym (Gibco) i ponownie zasiano w gęstości 1 × 104 komórek na cm2. Hodowane komórki przed przejściem drugim wykorzystano do eksperymentów. W przypadku ekspresji mRNA RBD in vitro komórki transfekowano mRNA za pomocą Lipofectamine Messenger MAX, zgodnie z sugestią producenta (Thermo Fisher).
Ultrawirowanie gradientu gęstości, oczyszczanie mleka-egzos (DC-mleko-exos)
Egzosomy mleka wyizolowano za pomocą ultrawirowania gradientu gęstości (DC). Krótko mówiąc, serwatkę bez kazeiny odwirowano przy 100 000 g (Beckman Coulter, USA) przez 105 minut w celu wytrącenia egzo-mleka ponownie zawieszonego w 1 ml PBS. Zagęszczone mleko-egzoskopy poddano wierzchołkowemu gradientowi gęstości nieciągłej, składającemu się z 2 mol/L, 1,65 mol/L, 1,3 mol/L, 0,95 mol/L i 0,6 mol/l sacharozy (7 ml objętości dla każdego kąta) w 250 mM roztworze Tris-HCl (pH 7,4). Odwirowywano je przy 100 000 g w temperaturze 4 °C przez 20 godzin. Zebrano frakcję mleko-egzos pomiędzy frakcjami 3 (1,3 mol/L) i 4 (1,65 mol/L). Aby usunąć sacharozę, frakcję rozcieńczono w PBS do końcowej objętości 40 ml i odwirowano w 100 000 g w temperaturze 4 ° C przez 105 min. Pellet zawiesinowano w 1 ml PBS. Przed użyciem egzoskopy mleka DC były przechowywane w temperaturze −80 °C.
Charakterystyka morfologii DC-mleko-egzoegzo-za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Morfologię DC-mleko-egzo-badano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), jak opisano wcześniej, z pewnymi modyfikacjami. Najpierw utrwalono DC-mleko-egzos (100 μg/ml) przez zmieszanie z równą objętością 4% (w/v) paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wybraną próbkę (10 μL) poddano następnie siatce TEM pokrytej węglem i przechowywano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Siatkę barwiono przez dodanie 10 μl roztworu szczawianu uranylu (4% octan uranylu, 0,0075 M kwasów szczawiowych, pH 7). Zabarwiona siatka została zbadana przez transmisyjny mikroskop elektronowy Hitachi 5600 plus działający przy 120 KV i powiększeniu 50 000.
Pomiar rozkładu wielkości cząstek DC-mleko-egzos za pomocą NanoFCM
Wielkość cząstek i liczbę próbek mleka egzos scharakteryzowano za pomocą instrumentu NanoFCM (NanoFCM Inc., Xiamen, Chiny) zgodnie z instrukcją operacyjną. Koktajl nanosfery krzemionkowej (Cat. S16M-Exo, NanoFCM Inc., Xiamen, Chiny) zawierający mieszaninę standardowych kulek 68 nm, 91 nm, 113 nm i 155 nm został użyty do dostosowania przyrządu do pomiaru wielkości cząstek. Parametry instrumentalne zostały ustawione następująco: Laser, 10 mW, 488 nm; rozpad SS, 10%; ciśnienie próbkowania, 1,0 kPa; okres pobierania próbek, 100 μs; czas nagrywania, 1 min.
Proteomika
Proteomika DC-milk-exos została przeanalizowana przez LC-MS/MS przy użyciu spektrometrów masowych Easy NLC1200-Q Exactive i Fusion Lumos Orbitrap (ThermoFisher), obu wyposażonych w nanoprzepływowe HPLC z odwróconymi fazami (Ultimate 3000 RSLC, Dionex). System nano-HPLC został wyposażony w kolumnę nanopułapki Acclaim PepMap (Dionex-C18, 100 A, 75 μm × 2 cm) oraz kolumnę analityczną Acclaim Pepmap RSLC (Dionex-C18, 100 A, 75 μm × 25 cm). Zazwyczaj dla każdego doświadczenia LC-MS/MS 1 μl mieszanki peptydowej umieszczano na kolumnie wzbogacania (pułapki) przy izokratycznym przepływie 5 μL/min 3% CH3CN zawierającego 0,1% kwasu mrówkowego przez 5 minut, zanim kolumna wzbogacająca została przełączona w linii z kolumną analityczną. Eluentami użytymi do LC były 0,1% (v/v) kwas mrówkowy (rozpuszczalnik A) i 100% CH3CN/0,1% (v/v) kwas mrówkowy. Stosowany gradient wynosił 3% B do 25% B przez 23 minuty, 25% B do 40% B w ciągu 2 minut, 40% B do 85% B w ciągu 2 minut i utrzymywał się na poziomie 85% B przez 2 minuty przed równowagą przez 10 minut przy 3% B przed następnym wstrzyknięciem. Wszystkie widma zebrano w trybie pozytywnym przy użyciu pełnego skanowania widm MS w trybie FT od m/z 300-1650 w rozdzielczościach 70 000 (QE) i 120 000 (Lumos). Dla obu instrumentów zastosowano masę zamka 445,12003 m/z. Dla MS/MS na Lumos zastosowano tryb akwizycji "maksymalnej prędkości" (czas cyklu 3 s) na najbardziej intensywnym prekursorze, w którym jony peptydowe o stanach ładunku ≥2 zostały wyizolowane z oknem izolacyjnym 1,6 m/z i rozdrobnione HCD przy użyciu znormalizowanej energii zderzenia 35. W przypadku MSMS na QE plus, 15 najbardziej intensywnych jonów peptydowych o stanach ładunku ≥2 zostało wyizolowanych z oknem izolacyjnym 1,6 m / z i rozdrobnionych przez HCD z normalizowaną energią zderzenia 35. Zastosowano dynamiczne wykluczenie 30 sekund.
Surowe pliki zostały przeszukane za pomocą Proteome Discover (wersja 2.1, Thermo Fisher, Niemcy) z Sequest jako wyszukiwarką. Tolerancje masy fragmentu i peptydu ustalono odpowiednio na 20 mDa i 10 ppm, co pozwoliło na maksymalnie 2 pominięte miejsca cięcia. Wskaźniki fałszywych odkryć białek, peptydów i fosfosytów wynosiły 1 procent. Białka ekspresji różnicowej zostały przeanalizowane przez DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) Bioinformatics Resource 2021 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/) z zalecanymi parametrami analitycznymi w celu zidentyfikowania najbardziej wzbogaconych szlaków transdukcji sygnału w zbiorze danych.
Zachodnia plama
Całkowite białka komórkowe i mleko-egzos ekstrahowano za pomocą buforu lizującego RIPA, a stężenie białka oznaczano za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (Thermo, A53226). Następnie białko załadowano do żelu do elektroforezy SDS-poliakryloamidu. Po elektroforezie białka przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu i zablokowano w 5% (wt/vol) albuminie surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie membranę inkubowano z anty-TSG101 (Abcam, ab125011), anty-CD9 (Abcam, ab92726), anty-RBD (Abcam, ab277628) lub anty-GAPDH (Proteintech, 60004-1) przez noc w temperaturze 4 °C. Po przemyciu w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Tris Tween (TBST), wtórne przeciwciało peroksydazy chrzanowej (HRP) rozcieńczono 1: 10 000 5% (wt / vol) BSA i inkubowano z membraną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Nadmiar przeciwciała wtórnego wypłukano z błony TBST, a sygnał chemiluminescencyjny wygenerowano za pomocą systemu FluorChem E (ProteinSimple, USA) zgodnie z protokołem producenta.
Pomiar potencjału zeta
Potencjał Zeta egzosomów mleka mierzono trzykrotnie w temperaturze 25 °C przy następujących ustawieniach: czułość 85, wartość migawki 70 i szybkość klatek 30 klatek na sekundę, podczas gdy oprogramowanie ZetaView zostało wykorzystane do zbierania i analizowania danych.
Budowa doustnej szczepionki dla egzosomów DC-mleka opartych na SARS-CoV-2 RBD (RBD-DC-milk-exos)
mRNA zaprojektowane do ekspresji białek RBD uzyskano od komercyjnego dostawcy (Novoprotein). MRNA RBD oczyszczono za pomocą kolumn CIMmultus Oligo dT i ponownie zawieszono w wodzie wolnej od DNazy i RNazy przy użyciu końcówek i probówek wolnych od nukleaz. Oczyszczone mRNA RBD przygotowano do ładowania do DC-mleka-egzos poprzez wstępną inkubację ich kationowymi lipidami, generując produkt lipidowo-mRNA. MRNA lipidowe zostały następnie wprowadzone do oczyszczonych egzo-mleka DC poprzez mieszanie i inkubację w celu skonstruowania doustnej szczepionki. Morfologię, rozkład wielkości cząstek i potencjał zeta obciążonych mRNA DC-mlek-egzos RBD scharakteryzowano odpowiednio za pomocą TEM, instrumentu NanoFCM i Zeta Pals. Wydajność ładowania mRNA RBD wykryto za pomocą opartej na Taqmanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Ekspresję mRNA RBD mierzono za pomocą western blot i testu immunoenzymatycznego (ELISA).
Ekstrakcja RNA i test RT-qPCR oparty na Taqmanie
Całkowite RNA ekstrahowano z egzoenzymów mleka RBD-DC przy użyciu TRIzolu (Life Technologies, Carlsbad, CA). Pierwsza nić cDNA została zsyntetyzowana przy użyciu PrimeScript™ RT Kit (TaKaRa, Pekin, Chiny) i używany jako szablon do określania ekspresji genów RBD za pomocą wskazanych starterów i sond. Zastosowano następujące sekwencje starterów: RBD, do przodu 5'-CTCCAGGGCAA ACTGGAAAG-3' i odwrotna 5'-AATTACCAACCAACCATAATCAAG-3', sonda, CCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAG, przy użyciu odczynnika Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) (TaKaRa, Pekin, Chiny) w qRT-PCR. Parametry cykliczne były następujące: reakcję PCR przeprowadzono na 50 ng próbek cDNA przy użyciu 0,2 μmol / L każdego startera, 0,4 μmol / L sondy RBD i 10 μL 2×Premix Ex Taq Mix. Zastosowano następujące warunki: 95 °C przez 30 s, 40 cykli w 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 31 s w Thermofisher QuantStudio5 i przeanalizowano za pomocą dedykowanego oprogramowania.
Test ELISA
Lizat komórkowy, supernatant hodowlany i surowica zostały homogenizowane w celu ekstrakcji białka. Ekspresję białka kolca RBD (Beyotime, Szanghaj, Chiny) i przeciwciała neutralizującego (Vazyme, Nanjing, Chiny) określono za pomocą zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.
Pomiar aktywności RBD in vitro
Sprawdziliśmy, czy doustna szczepionka dla egzosomów pochodzących z mleka DC opartych na SARS-CoV-2 RBD (RBD-DC-milk-exos) może dostarczyć funkcjonalne mRNA RBD do ludzkich komórek. W badaniach in vitro szczepionka doustna dodała otrzymane preparaty do hodowli komórek ludzkich, wyhodowała komórki w ciągu nocy, aby umożliwić wychwyt i ekspresję mRNA RBD, a następnie zbadała komórki pod kątem aktywności RBD za pomocą western blot i ELISA.
Weryfikacja funkcji dostarczania RBD-DC-mleko-egzos in vivo
Użyliśmy samic myszy BALB / c dopasowanych wiekowo (Speford (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Doświadczalnych Youji (Tianjin) Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (IACUC-20220726-05.00). Samice myszy BALB / c (23 ~ 26 g, Speford, Pekin, Chiny) były trzymane w obiekcie wolnym od patogenów ze standardowymi warunkami temperatury 24 ° C, 12-godzinnym cyklem światła / ciemności oraz pokarmem i wodą ad libitum. Myszy wykorzystano do zbadania aktywności mRNA-DC-mleka-egzos RBD podawanego przez wstrzyknięcie dwunastnicy. Myszy losowo podzielono na 2 grupy: 1) grupę kontrolną (sól fizjologiczna, 1000 μL) (N = 3); oraz 2) grupa RBD-DC-mleko-egzos (0,5 mg mRNA/1000 μL) (N = 5). Wszystkie zabiegi rozpoczynano od wstrzyknięcia dwunastnicy w dniach 1., 15. i 36. Wszystkie myszy zostały uśmiercone dwa tygodnie po ostatnim leczeniu 1% izofluranem. Krew pobierano w różnych punktach czasowych (dni 0, 7, 14, 21, 28, 35, 42 i 49). Weryfikację przeciwciał neutralizujących szczepionki doustnej dla egzosomów mlecznych opartych na SARS-CoV-2 in vivo przeprowadzono za pomocą analizy ELISA w surowicy. N = 3 (kontrola), N = 5 (RBD mRNA-DC-mleko-egzo), a dane przedstawiono jako średnią ± STD. **P < 0,01, ***P < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną.
Analizy statystyczne
Dane zostały przedstawione jako średnia i odchylenie standardowe. Test t-test niesparowanego ucznia został użyty do analizy danych tylko z dwoma zestawami. Przeprowadzono jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) w celu ustalenia, czy istnieje znacząca różnica między więcej niż dwoma zestawami danych, a następnie przeprowadzono test post hoc Bonferroniego przy użyciu GraphPad Prism 6.0. P < 0,05 uznano za statystycznie istotne dla różnic grupowych. gwiazdka (*) reprezentowała P < 0,05; podwójna gwiazdka (**) oznaczająca P < 0,01; potrójna gwiazdka (***) oznaczała P < 0,001.
Finansowania
Finansowanie zapewniła firma Tingo Exosomes Technology Co., Ltd, Tianjin, Chiny.
Wkład autora
Wszyscy autorzy zrecenzowali manuskrypt; X.H.G., L.L., Q.Z., M.W. i C.L.H. formułowali pomysły, projektowali badania i eksperymenty. Q.Z., M.W., C.L.H. i Z.J.W. przeprowadzili eksperymenty i wyprodukowali odczynniki; L.L, Q.Z., M.W., C.L.H., X.Z.M., D.L.Q., N.W. i J.H.W. przeanalizowali dane eksperymentalne; Prace nadzorowane przez H.Q.D. L.L. i Q.Z. napisali rękopis. Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania artykułu i zatwierdzili przesłaną wersję.
Konflikt interesów
Autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Dostępność danych i materiałów
Wszystkie dane są dostępne w tekście głównym lub w materiałach uzupełniających. Dalsze zapytania można kierować do autora korespondencyjnego.
Oświadczenie etyczne
Badanie na zwierzętach zostało przejrzane i zatwierdzone przez Experimental Animal Ethics Committee of Youji (Tianjin) Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (IACUC-20220726-05.00).
Potwierdzenia
Dziękujemy Hangping Rui za wsparcie administracyjne; a także dziękuję Fengbin Li, Mi Chen, Lin Ma, Tonglin Cui i Xiaohan Dai za ich doskonałą pomoc techniczną.
Odwołania
Obszar tematyczny
