Łączenie materiałów na bazie grafenu z komórkami neuronowymi

Wprowadzenie

Grafen (G) jest jedno- lub kilkuwarstwowym arkuszem Sp²-związane atomy węgla ciasno upakowane w dwuwymiarową (2D) sieć o strukturze plastra miodu, o grubości zaledwie 0,34 nm (Geim, 2009). Każdy atom węgla ma trzy wiązania μ i wiązanie π poza płaszczyzną, które może wiązać się z sąsiednimi atomami (Geim, 2009), co czyni G najcieńszym związkiem, jaki kiedykolwiek znany o grubości jednego atomu i najsilniejszym odkrytym związkiem. Ponadto jest lekki, elastyczny i przezroczysty oraz zarówno elektrycznie, jak i termicznie wysoce przewodzący, co otwiera możliwość zastosowania go w szerokim spektrum zastosowań, w tym w superkondensatorach (Hess i in., 2011; Sahoo i in., 2015; Casaluci i in., 2016), elastyczna elektronika (Eda i in., 2008; Meric et al., 2008), tusze drukowalne (Zhu et al., 2015; Bonaccorso i in., 2016), baterie (Hassoun i in., 2014; Dufficy i in., 2015), czujniki optyczne i elektrochemiczne (Pumera, 2009; Du et al., 2010; Kang i in., 2010), magazynowanie energii (El-Kady i Kaner, 2013; Bonaccorso i in., 2015; Ambrosi i Pumera, 2016) i medycyny (Novoselov i in., 2012; Casaluci i in., 2016; Kostarelos i in., 2017; Reina i in., 2017). Materiały związane z G (GRM) obejmują jedno- i kilkuwarstwowe G (1–10 warstw; GR), tlenek G (jednowarstwowy, stosunek 1:1 C/O; GO), zredukowany tlenek G (rGO), nano- i mikropłytki grafitu (ponad 10 warstw, ale grubość <100 nm i średni rozmiar boczny w kolejności odpowiednio nm i μm), kropki kwantowe tlenku G i G (odpowiednio GQD i GOQD) oraz różnorodne hybrydyzowane nanokompozyty G (Bianco, 2013; Wick i in., 2014; Cheng i in., 2016). Mając tak różny skład i strukturę, związki te posiadają bardzo zróżnicowane właściwości, które należy wziąć pod uwagę przy planowaniu zastosowań biomedycznych, ponieważ wywołują zupełnie inne reakcje biologiczne. W związku z tym zasadnicze znaczenie ma właściwa identyfikacja i scharakteryzowanie zastosowanych GRM, aby przezwyciężyć powszechny brak odtwarzalności wpływający na eksperymenty biologiczne z materiałami G.

W ciągu ostatnich kilku lat biomedyczne zastosowania G cieszyły się coraz większym zainteresowaniem, w tym wykorzystanie G i GRM do bioelektrod, bioobrazowania, dostarczania leków / genów / peptydów, sekwencjonowania DNA opartego na nanoporach, różnicowania komórek macierzystych i inżynierii tkankowej (Feng i in., 2013; Yang i in., 2013). Ponadto GRM wzbudziły duże zainteresowanie projektowaniem nanonośników i narzędzi do nanoobrazowania, dwu- i trójwymiarowych rusztowań tkankowych, powłok antybakteryjnych i bioczujników (Bitounis i in., 2013; Ding i in., 2015). Zainteresowanie zastosowaniem GRM w medycynie polega głównie na niezwykłych właściwościach G, w tym jego właściwościach mechanicznych, elastyczności, przezroczystości, przewodności cieplnej i dobrej biokompatybilności. GRM mogą zatem przezwyciężyć ograniczenia metali i krzemu, które są obecnie stosowane w urządzeniach do implantacji, ale charakteryzują się podwyższoną sztywnością, wysokim potencjałem zapalnym i słabą długoterminową stabilnością w środowiskach fizjologicznych. Ponadto dziedzina biomedycyny jest świadkiem silnego zapotrzebowania na innowacyjne terapie w celu oceny rosnącego zapotrzebowania na bardziej szczegółowe, bezpieczniejsze i skuteczne metody leczenia stanów patologicznych. Biorąc pod uwagę te przesłanki, wiele badań nad G koncentruje się na zastosowaniach medycznych, a zwłaszcza w dziedzinie neurologii, gdzie jego cechy mechaniczne i elektroniczne sprawiają, że jest silnym kandydatem do zastąpienia obecnych urządzeń (Kostarelos i in., 2017; Reina i in., 2017).

Innym atrakcyjnym aspektem urządzeń medycznych opartych na GRM jest rosnąca liczba dowodów biokompatybilności G, niezwykle ważnej kwestii, którą należy wziąć pod uwagę przy każdym nowym biomateriale wprowadzanym na rynek. Ze względu na swoją chemię, powierzchnia G umożliwia silne i nieniszczące interakcje na poziomie komórkowym, które można nawet poprawić poprzez specyficzną funkcjonalizację chemiczną (Cheng i in., 2016; Kang i in., 2016). Dotyczy to w szczególności podpór i rusztowań opartych na G zorientowanych na naprawę i regenerację tkanek, a w rzeczywistości wykazano już obiecujące wyniki w zakresie inżynierii tkanki nerwowej i kostnej (Cheng i in., 2016; Reina i in., 2017). W przypadku dyspersji nanoarkuszy G, przeznaczonych głównie do celów dostarczania leków/genów i obrazowania diagnostycznego, scenariusz jest bardziej złożony (Bramini i in., 2016; Mendonça i in., 2016a; Rauti i in., 2016). Bezpieczeństwo tego materiału jest nadal trudnym problemem do rozwiązania i każdy przypadek musi być analizowany oddzielnie, biorąc pod uwagę metodę syntezy, jakość produktu końcowego, w tym jego czystość i ewentualną obecność śladowych zanieczyszczeń, a także środowisko biologiczne, w którym G ma być stosowany.

Zastosowania grafenu w neuronauce

Biomedyczne zastosowania G stanowią dziedzinę ciągłej ekspansji. Tradycyjne metody leczenia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wiążą się z szeregiem wyzwań, dlatego opracowanie nowych narzędzi, które przewyższają najnowocześniejsze technologie obrazowania, dostarczania leków, regeneracji neuronów oraz rejestracji i wykrywania elektrycznego, jest jednym z głównych celów współczesnej medycyny i neurologii (Baldrighi i in., 2016). Od czasu opracowania materiałów związanych z węglem nanotechnologia wywarła silny wpływ na szereg zastosowań (rys. 1), w tym: dostarczanie leków, genów i białek, przekraczanie bariery krew-mózg (BBB) i docieranie do upośledzonych obszarów mózgu; techniki neuroregeneracyjne w celu przywrócenia komunikacji komórka-komórka po uszkodzeniu poprzez połączenie dwóch (2D) lub trzech (3D) rusztowań wymiarowych z komórkami nerwowymi; wysoce specyficzne i niezawodne narzędzia diagnostyczne do wykrywania biomarkerów choroby in vivo poprzez znakowanie komórek i monitorowanie w czasie rzeczywistym biologicznych cząsteczek czynnych; oraz monitorowanie i modulacja aktywności neuronów za pomocą bardzo czułych elektrod do nagrań i platform opartych na G do elektrycznej stymulacji lokalnej (Mattei i Rehman, 2014; John i wsp., 2015; Chen i in., 2017; Kostarelos i in., 2017; Reina i in., 2017).

W szczegółach naukowcy rozpoczęli już badania nad wykorzystaniem G w OUN do znakowania komórek i monitorowania żywych komórek w czasie rzeczywistym (Wang i in., 2014; Zuccaro i in., 2015); dostarczanie do mózgu cząsteczek, które są zwykle odrzucane przez BBB (Tonelli i in., 2015; Dong i in., 2016); Rusztowania G-based do hodowli komórkowej (Li N. et al., 2013; Menaa i in., 2015; Defterali i in., 2016b); oraz analiza komórek oparta na elektrodach G (Medina-Sánchez i in., 2012; Li i in., 2015). Ponadto zaproponowano, że połączenie G z komórkami nerwowymi jest niezwykle korzystne dla badania ich zachowania elektrycznego lub ułatwiania regeneracji neuronów poprzez promowanie kontrolowanego wydłużenia procesów neuronalnych (Li i in., 2011; Tu i in., 2014; Fabbro i in., 2016). Zastosowania te otwierają nowe kierunki badawcze w neuroterapii, w tym neuroonkologii, neuroobrazowaniu, neuroregeneracji, neurochirurgii funkcjonalnej i chirurgii nerwów obwodowych (Mattei i Rehman, 2014).

W tym przeglądzie skupimy się na kilku aspektach badań GRM, które uważamy za szczególnie interesujące dla przyszłych zastosowań neurologicznych, tj. (i) G jako nanonośnik do dostarczania leków i genów; (ii) interakcja G z BBB; oraz (iii) kompozyty 2D i 3D na bazie G do regeneracji, stymulacji i rejestracji neuronów. Ostatni (iv) rozdział poświęcony jest przeglądowi podejść do modelowania obliczeniowego, które mogą pomóc biologom i naukowcom medycznym lepiej zrozumieć molekularne i komórkowe interakcje G z żywymi systemami.

Jak dotrzeć do mózgu: nanonośniki na bazie G i bariera krew-mózg

Interakcja nanoarkusza grafenu z komórkami nerwowymi

Wspólne mechanizmy cytotoksyczności nanoarkuszy G zostały opisane w literaturze dotyczącej różnych typów komórek i obejmują fizyczne interakcje z błonami komórkowymi (Seabra i in., 2014); zakłócenie cytoszkieletu komórkowego (Tian i in., 2017); stres oksydacyjny spowodowany wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS; Chen M. i in., 2016; Mittal i in., 2016); uszkodzenie mitochondriów (Pelin i in., 2017); Uszkodzenia DNA, takie jak fragmentacja chromosomów, pęknięcia nici DNA, mutacje punktowe i oksydacyjne zmiany DNA (Akhavan i in., 2012; Fahmi i in., 2017); autofagia (Chen i in., 2014); oraz apoptoza i/lub martwica (Lim i in., 2016). Ponadto opublikowane dane sugerują, że GO jest mniej toksyczny niż G, rGO i uwodorniony-G; mniejsze nanoarkusze są mniej toksyczne niż duże płatki, a wysoce dyspergowalne roztwory G są bezpieczniejsze niż roztwory agregujące (Donaldson i in., 2006; Akhavan i in., 2012; Bianco, 2013; Kurapati i in., 2016; Ou i in., 2016).

W przypadku OUN mechanizmy interakcji GRM z neuronami i astrocytami są nadal słabo zbadane i niejasne, co obrazuje niezdefiniowany scenariusz zależny głównie od wewnętrznych cech GRM. Przeprowadzono niewiele badań na neuronalnych liniach komórkowych, wykazujących pewne toksyczne działanie G w dużych dawkach. W szczególności zarówno G, jak i nanorurki węglowe indukowały toksyczne odpowiedzi w komórkach PC12 w sposób zależny od stężenia i kształtu (Zhang i in., 2010). Po ekspozycji na G wygenerowano ROS i zauważono dowody apoptozy w stężeniu 10 μg / ml. Zgodnie z tym badaniem, nanoarkusze GO nie indukowały oczywistej cytotoksyczności w niskim stężeniu, ale zaobserwowano zależną od dawki i czasu śmierć komórek w linii komórkowej ludzkiego nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y (Lv i in., 2012). W odniesieniu do hodowli pierwotnych nie wykryto żadnych zmian w żywotności komórek neuronalnych i glejowych po ekspozycji na G, zarówno in vivo, jak i in vitro (Bramini i in., 2016; Mendonça i in., 2016b; Rauti i in., 2016). Jednak pierwotne kultury neuronalne wystawione na działanie nanoarkuszy GO wykazywały wyraźne zmiany w wielu szlakach fizjologicznych, takich jak homeostaza wapnia i lipidów, łączność synaptyczna i plastyczność (Bramini i in., 2016; Rauti i in., 2016). Po zinternalizowaniu w komórkach zaobserwowano, że nanoarkusze G preferencyjnie gromadzą się w lizosomach, a także fizycznie uszkadzają mitochondria, retikulum endoplazmatyczne i, w niektórych przypadkach, jądra (John i in., 2015). Inne badanie sugerowało, że nieregularne wypukłości i ostre krawędzie nanoarkuszy mogą uszkodzić błonę plazmatyczną, umożliwiając w ten sposób G wejście do komórki poprzez przebicie dwuwarstwy fosfolipidowej (Li Y. i in., 2013). Cechy te budzą dodatkowe obawy dotyczące bezpieczeństwa, ponieważ wolne GRM w cytoplazmie mogą prowadzić do zakłócenia cytoszkieletu, upośledzenia ruchliwości komórek i blokady cyklu komórkowego, podobnie jak cytotoksyczność indukowana nanorurkami węglowymi.

Opisane powyżej efekty zaobserwowano po przewlekłej ekspozycji na G, podkreślając potrzebę pilnej i dalszej oceny biokompatybilności materiału z tkankami nerwowymi w długoterminowych badaniach, mając nadzieję na powiązanie efektów in vivo z interakcjami komórkowymi i molekularnymi in vitro. Pierwsze mocne dowody toksyczności OUN wywołanej przez G pochodzą z niedawnego badania in vivo (Ren i in., 2016). Aby odtworzyć sytuację zanieczyszczenia środowiska G, naukowcy rozproszyli GO w wodzie w obecności larw Danio rerio (danio pręgowanego). Odsłonięte larwy wykazywały GO w OUN i, co najważniejsze, indukcję objawów podobnych do choroby Parkinsona, takich jak zaburzenie aktywności lokomotorycznej, utrata neuronów dopaminergicznych i tworzenie ciał Lewy'ego. Efekty te były prawdopodobnie konsekwencją uszkodzenia mitochondriów i apoptozy przez szlak kaspazy 8, w obecności bardziej ogólnego zaburzenia metabolicznego. Nanoarkusze G i GO gromadzą się w małych ilościach w OUN gryzoni po wstrzyknięciu dożylnym (iv.) bez uprzedniej funkcjonalizacji powierzchni (Mendonça i in., 2016a,b). rGO wykryto również w tkankach mózgu, szczególnie we wzgórzu i hipokampie, po wstrzyknięciu dożylnym, któremu towarzyszyło zakłócenie BBB (Mendonça i in., 2016b). Co ciekawe, szczury leczone płatkami rGO nie wykazywały żadnych klinicznych objawów neurotoksyczności, w tym żadnych oznak drżenia, drgawek, ślinienia się, łzawienia, duszności i zaburzeń motorycznych. Odkrycia te kontrastują z pracami przeprowadzonymi przez Zhang et al. (2015), którzy zgłosili krótkotrwały spadek aktywności ruchowej i koordynacji nerwowo-mięśniowej u myszy podawanych doustnie z nanoarkuszami rGO. Ta rozbieżność podkreśla, że droga podania jest kluczowym parametrem przy określaniu biokompatybilności G. Tak więc portal wejścia G do organizmu, wraz z jego dawką, wielkością, funkcjonalizacją i agregacją, określi ostateczne efekty biologiczne.

Podsumowując, obecne dane dotyczące biokompatybilności G nanosheet są nadal kontrowersyjne. Wynika to z dużej heterogeniczności materiałów obecnych na rynku i dużej różnorodności metod syntezy. W zależności od źródła grafitu (materiału wyjściowego), metody syntezy, zastosowania chemikaliów i formy dyspersyjnej (roztwór lub proszek) produktu końcowego, G może prezentować różne rozmiary, grubość, powierzchnię chemiczną i stan agregacji, które w różnym stopniu wpływają na jego interakcję z systemami biologicznymi. Oczywiste jest jednak, że nanoarkusze G mogą powodować niekorzystne skutki dla środowiska i zdrowia, pozostawiając otwartą debatę na temat ich wykorzystania jako platformy biomedycznej (Bramini i in., 2016; Reina i in., 2017). Do chwili obecnej nanoarkusze GO są preferowane w odniesieniu do nieskazitelnego G do badań biomedycznych, ze względu na ich dużą rozpuszczalność i stabilność w płynach biologicznych (Chowdhury i in., 2013; Servant i in., 2014a; Reina i in., 2017).

Grafen do dostarczania biomolekuł do ośrodkowego układu nerwowego

Jak wspomniano powyżej, zastosowanie dyspersji nanoarkuszy G do zastosowań biomedycznych może dać pewne niepożądane efekty ze względu na wewnętrzne cechy materiału. Co ciekawe, funkcjonalizacja powierzchni G mogłaby złagodzić większość tych wad. Właściwości fizykochemiczne nanoarkuszy G można dostroić do wyższego stopnia biokompatybilności. Co więcej, ładunki mogą być ładowane poprzez interakcje układania π−π, wiązania wodorowe lub oddziaływania hydrofobowe (Georgakilas i in., 2016), co daje atrakcyjną możliwość wykorzystania G jako platformy do dostarczania biomolekuł, które są zwykle odrzucane przez BBB. W rzeczywistości duża dostępna powierzchnia i możliwość koniugacji różnych cząsteczek na jej powierzchni sprawiają, że G jest odpowiednim materiałem do przechowywania i przenoszenia leków, genów (w tym siRNA i miRNA), przeciwciał i białek (Chen i in., 2013). Ponadto możliwa jest również modyfikacja jego struktury chemicznej poprzez dodanie grup funkcyjnych, takich jak grupy aminowe, karboksylowe, hydroksylowe, alkilohalogenowe lub azydkowe (John i in., 2015). Funkcjonalizacja powierzchni ma podwójną zaletę: ładuje dużą ilość biomolekuł i specyficznie dostarcza je do komórek docelowych, umożliwiając jednocześnie bardziej jednorodną dyspersję materiału, ponieważ czysty G jest wysoce hydrofobowy i ma tendencję do agregowania w roztworze wodnym, w tym płynach biologicznych zawierających sole i białka (Mattei i Rehman, 2014; John i wsp., 2015). Ponadto funkcjonalizowane nanoarkusze G mogą być stosowane w systemowych, ukierunkowanych i lokalnych systemach dostarczania (Feng et al., 2011; Kim i in., 2011; Liu J. i in., 2013). W ten sposób takie podejście może zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na wielofunkcyjne i wszechstronne platformy medyczne.

Ze względu na unikalne profile fluorescencyjne, fotoakustyczne i rezonansu magnetycznego, w kilku badaniach zbadano również możliwość włączenia nanocząstek na bazie G (NP) w celu poprawy wizualizacji guzów mózgu in vivo i poprawy ukierunkowania guza na molekularne strategie przeciwnowotworowe (Kim i in., 2011; Yang i in., 2012; Zhang i in., 2013; Hsieh i in., 2016). Również w tym przypadku badania in vivo wykazały, że GO, bardziej niż GR, ma dobry potencjał dla tych zastosowań, w rzeczywistości ogólnoustrojowo podawany znakowany radioizotopem GO (¹⁸⁸Re-GO) może dotrzeć do miąższu mózgu, choć w niewielkiej ilości (0,04%; Zhang X. i in., 2011).

Przekraczanie bariery krew-mózg

BBB jest jedną z najważniejszych barier fizjologicznych w organizmie, tworząc dynamiczny interfejs, który oddziela mózg od układu krążenia (Pardridge, 2001; Begley, 2004). Barierę tworzą komórki śródbłonka naczyń mózgowych, otoczone blaszką podstawną i okołyskularnymi stopami astrocytów, które łączą system barierowy z neuronami (Abbott i in., 2010). Wraz z perycytami i komórkami mikrogleju komórki śródbłonka wspierają funkcję bariery i regulują jej sygnalizację międzykomórkową w celu kontrolowania przepływu i transportu do mózgu (Dohgu i in., 2005; Abbott i in., 2010). BBB, wraz z nabłonkiem splotu pajęczynówki i splotu naczyniówkowego, ogranicza przepływ różnych substancji chemicznych i obcych materiałów między krwioobiegiem a tkanką neuronalną, jednocześnie umożliwiając przepływ substancji i składników odżywczych niezbędnych do funkcji metabolicznych, od tlenu do różnych białek, takich jak insulina i apolipoproteina E (Abbott i in., 2006; Strazielle i Ghersi-Egea, 2013). Interesującym punktem jest to, że komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu wyraźnie różnią się od komórek śródbłonka w innych dzielnicach ciała, ponieważ wykazują większą liczbę przylegaczy i ciasnych połączeń między sąsiednimi komórkami, tak że nie istnieją międzykomórkowe fenestracje (Abbott i in., 2006, 2010). Ciasne połączenia między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych mózgu są jednym z najważniejszych elementów strukturalnych i anatomicznych BBB. Tworzą główną barierę, ściśle wiążąc ze sobą błony komórkowe i regulując ruchy parakomórkowe wody, cząsteczek, jonów i innych biomolekuł (Begley i Brightman, 2003; Abbott i in., 2010). Opierając się na tych cechach, niektórzy badacze podkreślili, że właściwości przepuszczalności BBB odzwierciedlają szczelność połączeń międzykomórkowych między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych mózgu (Rubin i in., 1991). Innymi słowy, niska przepuszczalność charakteryzująca BBB jest spowodowana w przeważającej części ciasnymi i przylegającymi połączeniami, które ograniczają pasaż parakomórkowy (Wolburg i Lippoldt, 2002). W rezultacie większość ruchu molekularnego jest zmuszona do podążania drogą transkomórkową przez BBB, zamiast poruszać się parakomórkowo przez skrzyżowania, jak w większości śródbłonków (Abbott i Romero, 1996; Wolburg i Lippoldt, 2002; Hawkins i in., 2006).

Do tej pory zidentyfikowano kilka mechanizmów transportu przez BBB (ryc. 2), w tym szlaki parakomórkowe lub transkomórkowe, białka transportowe (nośniki), transcytozę za pośrednictwem receptora i transcytozę adsorpcyjną (Abbott i in., 2006). Transcytoza jest procesem, w którym biomolekuły są wchłaniane przez inwazję błony plazmatycznej, a następnie transportowane z jednej strony spolaryzowanej monowarstwy komórkowej na drugą. Specyficzne białka, takie jak insulina i transferyna, są pobierane przez endocytozę i transcytozę za pośrednictwem receptora, proces znany jako transport za pośrednictwem receptora (Kreuter i in., 2002; Rip i wsp., 2009; Ulbrich i in., 2009, 2011). Natywne białka osocza, takie jak albumina, są słabo transportowane, ale kationizacja może zwiększyć ich wychwyt przez endocytozę i transcytozę za pośrednictwem adsorpcji (Abbott i Romero, 1996; Pardridge, 2007a). Oprócz transcytozy, bardzo małe związki rozpuszczalne w wodzie mogą przenikać przez ciasne połączenia przez parakomórkowy szlak wodny. W transporcie parakomórkowym ciasne połączenia działają jak "strażnik" i regulują parakomórkową dyfuzję środków rozpuszczalnych w wodzie. Na przykład sacharoza jest cząsteczką rozpuszczalną w wodzie i jest w stanie przekroczyć BBB w ograniczonych ilościach przez dyfuzję parakomórkową (Ek i in., 2006). Duża powierzchnia błony lipidowej śródbłonka oferuje również skuteczną drogę dyfuzyjną (transport transkomórkowy) dla małych cząsteczek gazowych, takich jak O₂ oraz środki rozpuszczalne w lipidach, w tym leki takie jak barbiturany i etanol. Śródbłonek zawiera ponadto białka transportowe dla glukozy, aminokwasów, zasad purynowych, nukleozydów, choliny i innych substancji. Niektóre transportery, tj. glikoproteina P, są zależne od energii i działają jako transportery wypływu (transport aktywno-wypływowy).

Opisana powyżej złożona sieć systemów transportowych nadaje BBB istotną funkcję neuroprotekcyjną, która ma jednak pewne wady, ponieważ BBB utrudnia również przechodzenie leków na choroby OUN. Firmy farmaceutyczne zainwestowały znaczny wysiłek i sumy w próby zaprojektowania leków, które mogą przekroczyć BBB, z bardzo ograniczonym sukcesem. Doniesiono, że tylko 5% całkowitej ilości leków opracowanych na choroby neuronalne faktycznie dociera do OUN (Pardridge, 2007b).

Inżynieria nanocząstek

Potencjał terapeutyczny ekspozycji na NP zależy głównie od szybkości penetracji NP po dostarczeniu ze środowiska zewnętrznego do wewnętrznych biokompartmentów. W związku z tym bariery biologiczne mają kluczowe znaczenie dla określenia biologicznego wpływu ekspozycji na NP. Nanomateriały oferują ogromny potencjał terapeutyczny i diagnostyczny, ale także zwiększają możliwość niezamierzonego dostępu do mózgu (Herda i in., 2014). Badania in vivo wykazały, że NP można znaleźć w OUN na różnych sposobach podawania (Semmler-Behnke i in., 2008; Zensi i in., 2009, 2010). Równolegle do badania translokacji NP wykorzystano i opracowano modele in vitro ludzkiego i mysiego BBB (Andrieux i Couvreur, 2009; Ragnaill i in., 2011; Bramini i in., 2014; Herda i in., 2014; Raghnaill i in., 2014).

Zaproponowano i przetestowano liczne nanosystemy dostarczania do celów terapeutycznych, zarówno in vitro, jak i in vivo (Pandey i in., 2015). Wśród najnowocześniejszych systemów polimerowe nanocząsteczki są obiecujące ze względu na ich wysoką zdolność kapsułkowania leków, dzięki czemu chronią i transportują leki hydrofobowe bez uszkadzania struktury BBB (Tosi i in., 2008). Wiązanie apolipoproteiny E z NP zostało zasugerowane jako mechanizm, dzięki któremu NP mogą wykorzystywać istniejące ścieżki dostępu do mózgu (Kreuter et al., 2002; Wagner i in., 2012) i rzeczywiście zwiększa wchłanianie narkotyków (Michaelis i in., 2006). Takie podejście jest szczególnie obiecujące w przypadku liposomów, które są wysoce biokompatybilne (Re i in., 2011). Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie transcytozy za pośrednictwem receptora poprzez łączenie określonych peptydów z powierzchnią NP było najlepiej zbadanym systemem w dziedzinie krzyżowania BBB. Różne cząsteczki, takie jak transferyna, insulina, lektyna i lipoproteiny, fizjologicznie wykorzystują tę drogę do przejścia z krwiobiegu do mózgu; w ten sposób ligandy te mogą zwiększyć stosunek pasażu NP obciążonych lekami przez BBB w celach terapeutycznych (Herda i in., 2014; Pandey i in., 2015; Åberg, 2016). Niedawno egzogenne peptydy, o których wiadomo, że ulegają transcytozie w BBB, zostały również wszczepione na powierzchnię NP, aby zwiększyć ich wejście do OUN. W tym przypadku szczególną uwagę zwrócono na receptor toksyny błoniczej (DTR) i białka ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV)-TAT. Zmutowany mutant DTR bez toksyczności lub immunogenności został przetestowany pod kątem transportu nano-liposomów i polibutylocyjanoakrylanowych NP przez BBB, zarówno in vitro, jak i in vivo, i rzeczywiście, tylko szczepione nanocząsteczki były w stanie transcytozować barierę (van Rooy i in., 2011; Kuo i Chung, 2012; Kuo i Liu, 2014). Ta sama strategia była skuteczna przy użyciu pochodnej białka HIV-TAT, połączonej z powierzchnią miceli polimerowych lub SiO₂ NPs poprzez cząsteczki glikolu polietylenowego (PEG) (Liu et al., 2008a,b; Zhao X. i in., 2016). Ponadto nanocząsteczki szczepione przeciwciałami zostały zsyntetyzowane w celu specyficznego ukierunkowania na receptory śródbłonka naczyniowego mózgu (Loureiro i in., 2014; Saraiva i in., 2016), w celu wykorzystania fizjologicznych mechanizmów transcytozy BBB. Po raz kolejny najbardziej obiecujące wyniki uzyskano z przeciwciałami antyinsulinowymi (Ulbrich i in., 2011), antytransferynowymi (Clark i Davis, 2015) i anty-LDL (Kreuter, 2014). Mimo że ostatnie osiągnięcia w inżynierii przeciwciał poprawiły wiedzę na temat terapii mózgu, zwiększając swoistość celowania i unikając peryferyjnej utraty materiału, nadal należy podjąć znaczne wysiłki, aby przełożyć te odkrycia z badań na zastosowania kliniczne.

Głównym wyzwaniem sferycznych NP jest to, że trudno jest uzyskać wieloczynnikowy system inżynieryjny zdolny do enkapsulacji leku, przekraczania BBB przez endocytozę za pośrednictwem receptora i wreszcie celowania w określoną subpopulację komórkową. W rzeczywistości, mimo że NP mają dużą powierzchnię, przestrzeń do inżynierii peptydów i cząsteczek na powierzchni w celu napędzania i prowadzenia systemu w kierunku różnych przedziałów ciała jest nadal ograniczona. W tym scenariuszu niedawno opracowano nowe podejścia, które łączą zewnętrzną modulację przepuszczalności BBB z inżynierią NP, które są obecnie badane.

Pokrycie surfaktantów i hipertermia

Bardzo podobne podejście do opisanej powyżej modyfikacji powierzchni NP ligandami polega na pokrywaniu NP środkami powierzchniowo czynnymi (Pardridge, 2012). Strategia ta indukuje przejściowe przerwanie ciasnych połączeń, co prowadzi do większej przepuszczalności śródbłonka, umożliwiając w ten sposób dużym cząsteczkom i nanonośnikom łatwe przekraczanie BBB i docieranie do mózgu (Pardridge, 2012; Saraiva i in., 2016). Ponadto poli(sorbat 80) może adsorbować apolipoproteinę E i/lub A-I, dodatkowo dając NP zdolność wiązania receptorów lipoprotein wyrażonych w śródbłonku mózgu i przekraczania BBB (Kreuter et al., 2003; Petri i in., 2007).

W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy przyjęli innowacyjne strategie mające na celu zmniejszenie uszkodzeń BBB i zwiększenie ilości leku transportowanego do OUN. Jeden z nurtów badań miał na celu uzyskanie specyficznej dla czasu i obszaru regulacji przepuszczalności BBB, aby ułatwić przejście NP. Osiągnięto to na przykład poprzez aktywację receptora adenozyny A2A, który zwiększa przestrzeń międzykomórkową między śródbłonkiem naczyń włosowatych mózgu (Gao i in., 2014). Podobny efekt można uzyskać poprzez fizyczną interakcję z BBB poprzez wywołanie hipertermii, procedury, która zwiększa lokalną temperaturę śródbłonka do 41-43 ° C. Zmiana temperatury działa poprzez selektywne zakłócanie ciasnych połączeń i zwiększa parakomórkową przepuszczalność BBB. Interesujące wyniki uzyskano przy użyciu skupionych ultradźwięków (FUS) i mikropęcherzyków, które wykazały bardzo niską toksyczność tkankową i wysoką akumulację doksorubicyny (DOX) w OUN (Treat et al., 2007). Inne techniki wytwarzania hipertermii to mikrofale i częstotliwość radiowa. Ta ostatnia została przetestowana in vivo w leczeniu glejaka, w połączeniu z klasyczną chemioterapią i radioterapią, wykazując zachęcające wyniki (Wang i in., 2012). Wreszcie, dwie bardziej zaawansowane strategie wywoływania hipertermii zostały ostatnio przetestowane: impuls laserowy i ogrzewanie magnetyczne. Ultrakrótkie impulsy laserowe w bliskiej podczerwieni (NIR) wywoływały zakłócenia BBB w wybranych regionach, umożliwiając w ten sposób przejście dużych cząsteczek w mózgu (Choi i in., 2011). Zamiast tego magnetyczne NP (MNP) były wykorzystywane do dostarczania związków bioaktywnych poprzez ciepło generowane z ogrzewania magnetycznego, przy użyciu pola o niskiej częstotliwości radiowej (Tabatabaei i in., 2015). Ponieważ lokalizacja MNP może być również monitorowana na żywo, technika ta może być stosowana zarówno do leczenia, jak i diagnozowania chorób.

Pomimo obiecujących wyników, techniki, które modulują i zakłócają przepuszczalność BBB, nawet jeśli przejściowo i lokalnie, są obarczone poważnym problemem, tj. bardzo słabą kontrolą nad przejściem niepożądanych cząsteczek i / lub mikroorganizmów, które zasiedlają krwioobieg. Jeśli prawdą jest, że ilość leku docierającego do mózgu zwiększa się po ciasnym otwarciu połączenia, prawdą jest również, że toksyczne związki, bezpiecznie ograniczone do naczyń krwionośnych przez nienaruszony BBB, mogą przechodzić w tym samym czasie, stwarzając wysokie ryzyko dla pacjenta.

Grafen i BBB: nowy sposób dostarczania leków i genów do mózgu

Głównym celem każdego systemu dostarczania leków jest stworzenie inteligentnego narzędzia, które rozpoznaje określone cele i uwalnia lek w kontrolowany sposób (Allen i Cullis, 2004). Głównym ograniczeniem zastosowań G w neurobiologii jest jego bardzo niska akumulacja w miąższu mózgu po wstrzyknięciu dożylnym. Po wstrzyknięciu dożylnym G angażuje się w jony, lipidy i białka, powodując agregację materiału i tworzenie korony biomolekularnej, która może wpływać na dystrybucję G i wywoływać reakcje zapalne (Dell'Orco i in., 2010). Ponadto nanoarkusze mogą być fagocytozowane przez makrofagi, indukując aktywację i uwalnianie cytokin prozapalnych (Zhou i in., 2012) i oddziałują z kilkoma składnikami krwi indukującymi hemolizę (Liao i in., 2011). Wreszcie, nanoarkusze G mogą gromadzić się w układzie siateczkowo-śródbłonkowym, a nie w tkance, na którą są kierowane (McCallion i in., 2016).

Szczególnie trudne jest przejście przez BBB, które znacznie ogranicza dostarczanie leków, blokując około 100% neuroterapeutyków wielkocząsteczkowych i ponad 98% wszystkich leków drobnocząsteczkowych (Upadhyay, 2014). Zgodnie z Mendonça et al. (2016b) systemowo wstrzykiwane nanoarkusze rGO przekraczają BBB poprzez przejściowy spadek szczelności parakomórkowej BBB i gromadzą się we wzgórzu i hipokampie szczurów. Wręcz przeciwnie, funkcjonalizacja rGO z PEG, zwykle stosowana w celu poprawy biokompatybilności nanomateriałów, indukuje rozpad BBB i dysfunkcje astrocytów in vivo (Mendonça i in., 2016a). Wśród różnych podejść, aby G przekroczył BBB, ultradźwięki zastosowano u myszy, aby fizycznie otworzyć ciasne połączenia BBB i umożliwić systemowi dostarczania leku wejście do mózgu. Postępując zgodnie z tą metodą, nanoarkusze GO przeszczepione Gd-DTPA i dendrymerem poli(amidoaminy) i obciążone EPI i supresorem guza miRNA Let-7, mogą dotrzeć do mózgu po wstrzyknięciu żyły ogonowej (Yang i in., 2014). Główną zaletą tego podejścia jest odwracalność otwarcia BBB. Co ciekawe, G pozwolił jednocześnie na analizę MRI o wysokim kontraście i kwantyfikację rozkładu systemu dostarczania wewnątrz tkanki mózgowej (Yang i in., 2014). Wyniki te są obiecujące, jednak potrzebne są dogłębne badania farmakokinetyczne i toksykologiczne, szczególnie w przypadku długotrwałego leczenia, pamiętając, że w odniesieniu do tego, co badano do tej pory, technika ta osiąga znacznie wyższą akumulację G w OUN.

Alternatywnie, powierzchnia G może być funkcjonalizowana za pomocą specyficznych biomolekuł, które umożliwiają materiałowi przejście przez BBB (Allen i Cullis, 2004; Goenka i in., 2014; John i wsp., 2015). W niedawnych badaniach zbadano innowacyjny system nano-dostarczania o wysokiej nośności i zachowaniu zależnym od pH. The GO@Fe₃O₄ nanokompozyt skoniugowano z laktoferyną (Lf), glikoproteiną surowicy transportującą żelazo, która wiąże się z receptorami o nadmiernej ekspresji na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego BBB i komórek glejaka, w celu uzyskania Lf@GO@Fe₃O₄. Po załadowaniu NP DOX, lekiem stosowanym w leczeniu glejaka (ryc. 3), wstrzyknięto dożylnie NP i zaobserwowano, że cząstki migrują z krwiobiegu do komórek glejaka (Liu G. i in., 2013). NP były bardziej skoncentrowane w OUN w porównaniu z innymi narządami i zaobserwowano wyższą skuteczność regresji nowotworu w porównaniu z kontrolą zwierząt, którym wstrzyknięto sam DOX. Podążając za podobnym podejściem i z podobnymi obiecującymi wynikami, Yang L. et al. (2015) funkcjonalizowali nanoarkusze PEG-GO z białkiem Tat HIV, co pozwoliło obciążonemu lekiem systemowi PEG-GO przekroczyć BBB przez transcytozę, pozostawiając w pełni zachowany śródbłonek barierowy.

Jak wspomniano wcześniej, inną obiecującą strategią kwestionowania BBB jest powlekanie NP środkami powierzchniowo czynnymi (Kreuter et al., 2003; Gelperina i in., 2010). Kanakia et al. (2014) poprawili dostarczanie GO do OUN poprzez funkcjonalizację nanoarkuszy za pomocą dekstranu; stwierdzono, że materiał przekracza BBB i dociera do mózgu bez wywierania toksycznego działania. Co zaskakujące, stężenie GO w OUN wzrastało z czasem, pozostając prawie nieobecne w innych narządach. Tak więc badanie sugeruje powolną akumulację G w OUN i długotrwałą trwałość materiału, co jest zachęcające z punktu widzenia systemu dostarczania leków, ale także budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa długoterminowej toksyczności nanoarkuszy G (Baldrighi i in., 2016), kwestia, którą nadal należy ocenić.

Rośnie liczba leków skutecznie powiązanych z nanoarkuszami G. Liu Z. i in. (2008) wykazali, że płatki GO-PEG można ozdobić nierozpuszczalną w wodzie cząsteczką aromatyczną 7-etylo-10-hydroksy-kamptotecyną (SN38), poprzez niekowalencyjne interakcje van der Waalsa. Podobnie inne leki, w tym różne analogi kamptotecyny (Liu Z. i in., 2008), Iressa (gefitinib; Liu Z. et al., 2008) oraz DOX (Sun et al., 2008) zostały z powodzeniem przyłączone do kompleksu GO-PEG poprzez proste wiązanie niekowalencyjne. Cząstki rGO-PEG były w stanie przekroczyć warstwę śródbłonka BBB bez przerywania ciasnych połączeń, zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo (Mendonça i in., 2016a,b). Niedawno Xiao et al. (2016) zastosowali GQD sprzężone z peptydem neuroprotekcyjnym. Po wstrzyknięciu dożylnym w mysim modelu choroby Alzheimera byli w stanie zwiększyć uczenie się i pamięć, tworzenie kolców dendrytycznych i zmniejszyć prozapalny poziom cytokin.

Jednym z głównych zastosowań systemów dostarczania leków opartych na G jest terapia przeciwnowotworowa, poprzez łączenie kompozytów G z chemioterapeutykami. Biorąc pod uwagę ich silną absorbancję optyczną w regionie NIR, materiały hybrydowe na bazie G są również intensywnie badane pod kątem ich obiecujących zastosowań w fototerapii nowotworów (Liu i in., 2011; Robinson i in., 2011; Yang i in., 2012; Hönigsmann, 2013). Uzasadnieniem wykraczającym poza to podejście jest wykorzystanie ciepła wytwarzanego przez G nagromadzone w regionach nowotworowych podczas stymulacji laserowej NIR w celu zabicia komórek nowotworowych. Technika ta została z powodzeniem zastosowana in vitro przy użyciu komórek glejaka U251 (Markovic i in., 2011). Takie eksperymentalne podejścia są szczególnie interesujące, ponieważ mogą pomóc w przezwyciężeniu ograniczeń narzuconych przez BBB (Abbott, 2013) i są bardzo obiecujące, szczególnie w leczeniu bardzo opornych i agresywnych nowotworów, takich jak glejak.

Wewnętrzne właściwości G w zakresie widzialnym (VIS) i NIR sprawiają, że jest to również atrakcyjne narzędzie do bioobrazowania (Zhang i in., 2013) zarówno in vitro, jak i in vivo (Gollavelli i Ling, 2012). Na przykład kompleksy aptamer-karboksyfluoresceina/GO wykorzystano do monitorowania wewnątrzkomórkowego i sondowania molekularnego in situ określonych skupisk żywych komórek, takich jak sztucznie wszczepione guzy myszom. Nanoarkusze GO wykorzystano również do obrazowania fotoakustycznego, które opiera się na reakcji akustycznej na rozszerzanie się ciepła po absorpcji energii optycznej (Wang i in., 2010; Yang i in., 2010; Qian i in., 2012). W szczególności w przypadku zastosowań w OUN, badania in vivo wykazały, że PEG-GO podawany wewnątrzczaszkowo i jego pochodne można obrazować w mózgu za pomocą mikroskopii dwufotonowej (Qian i in., 2012). Dzięki tej technice obrazowania można zrekonstruować mapę dystrybucji 3D w miąższu mózgu ze względu na wysoką penetrację tkanki sygnału fluorescencyjnego kompozytów PEG-GO. Te obiecujące wyniki mogą prowadzić do wykorzystania G jako narzędzia diagnostycznego do obrazowania zmian nowotworowych mózgu, zwłaszcza jeśli materiał jest zaprojektowany z biomolekułami, które specyficznie celują w komórki nowotworowe. Ponadto, po osiągnięciu celu, właściwości G można zoptymalizować zgodnie z konkretnym zastosowaniem, tj. Rozmiar i stan utlenienia można zmienić, aby przesunąć długość fali emisji z VIS na NIR, która ma głębszą penetrację tkanki, poprawiając w ten sposób głębokość urządzenia do obrazowania diagnostycznego. Łącząc właściwości optyczne G z innymi biodegradowalnymi i funkcjonalnymi materiałami, możliwe będzie tworzenie kompozytów i hybryd na bazie G odpowiednich do kilku zastosowań obrazowania na żywo. Do tej pory większość narzędzi została przetestowana in vitro na liniach komórek nowotworowych oraz in vivo do wykrywania i diagnozowania raka, pozostawiając bez uwzględnienia możliwość wykorzystania ich do badania i obrazowania OUN (Zhang i in., 2013; Cheng i in., 2016).

Podobnie jak w przypadku dostarczania leków, również inżynieria genetyczna może wykorzystywać właściwości G i otwierać nowe możliwości w biomedycynie. Koncepcja w tym przypadku polegałaby na dostarczaniu kwasów nukleinowych, tj. DNA lub różnych typów cząsteczek RNA, w tym miRNA i shRNA, do określonych populacji komórek docelowych, w celu przywrócenia warunków fizjologicznych (Cheng i in., 2016). Rozwój systemów niewirusowych ma ogromne znaczenie dla przyszłych podejść medycznych, ponieważ G może umożliwić przezwyciężenie niektórych wewnętrznych ograniczeń systemów wirusowych, takich jak trudności w dostosowaniu długich kwasów nukleinowych, zmiany między partiami, podwyższone koszty i immunogenność systemów wektorów wirusowych (Kim i in., 2011; John i wsp., 2015). Opracowano różne strategie, w tym dekorację dodatnio naładowanymi polimerami (PEI, BPEI), dendrymerami (PAMAM) i polisacharydami, które zwiększają wydajność transfekcji genów poprzez promowanie interakcji z błoną komórkową (Liu i in., 2014; Paul i in., 2014). Ponieważ technika funkcjonalizacji jest taka sama, zarówno leki, jak i geny mogą być dostarczane jednocześnie przy użyciu materiałów hybrydowych na bazie G (Zhang L. i in., 2011). Miałoby to efekt synergiczny, ponieważ przyniosłoby znaczne zwiększenie skuteczności leku, a także transfekcji. Na tej linii G-nanoarkusze funkcjonalizowano kationowym polimerem PEI, niewirusowym wektorem genowym, który tworzy silne oddziaływania elektrostatyczne z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi zarówno RNA, jak i DNA (Feng i in., 2011). Chen et al. (2011) poszli o krok dalej, którzy wykorzystali funkcjonalizowane PEI GO do dostarczania genów, uzyskując wysoką wydajność transfekcji przy braku jakiegokolwiek efektu cytotoksycznego.

Podsumowując, systemy dostarczania oparte na G, gdy są wygodnie funkcjonalizowane lub powiązane z technologiami uzupełniającymi, stanowią obiecujących kandydatów zarówno do diagnostyki (tj. Obrazowania), jak i terapeutycznych (tj. Dostarczania leków i genów) zastosowań neurologicznych. Co więcej, pomimo niewielu badań wykazujących toksyczne skutki ekspozycji układu nerwowego na gołe G i rGO (Bramini i in., 2016; Mendonça i in., 2016b; Rauti i in., 2016), do tej pory nie ma solidnych dowodów na to, że funkcjonalizowane G jest szkodliwe dla komórek neuronalnych i BBB. Ponieważ technologie G do zastosowań biomedycznych stale i szybko ewoluują, w niedalekiej przyszłości mogą pojawić się nowe bezpieczne i wysoce neurokompatybilne materiały.

Substraty grafenowe jako interfejsy neuronalne

Inżynieria tkankowa ma na celu przywrócenie funkcjonalności zakłóconej tkanki poprzez połączenie jej z odpowiednimi biomateriałami. Jest to szybko rozwijająca się dziedzina badań wymagających innowacyjnych podejść do uzyskania wysoce biokompatybilnych, funkcjonalnych i mało inwazyjnych implantów do długoterminowych zastosowań. Jeśli chodzi o układ nerwowy, aktywne i dynamiczne urządzenia wszczepialne są niezwykle korzystne, ponieważ pozwalają jednocześnie stymulować i rejestrować aktywność elektryczną komórek nerwowych. Opracowano różne typy wszczepialnych urządzeń do stosowania jako interfejsy neuronowe. Wśród nich znajdują się implanty głębokiej stymulacji mózgu (DBI) do elektrycznej stymulacji głębokich struktur w OUN, klinicznie stosowane w leczeniu dystonii i drżenia w chorobie Parkinsona (Perlmutter i Mink, 2006), implanty siatkówki i ślimaka do elektrycznej stymulacji ocalałych neuronów w obecności zwyrodnienia siatkówki lub do przekształcania dźwięków zewnętrznych w impulsy elektryczne (Spelman, 2006 r.; Picaud i Sahel, 2014), stymulatory ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego do rehabilitacji ruchowej po uszkodzeniach rdzenia kręgowego (Hatsopoulos i Donoghue, 2009) oraz elektrody wewnątrzczaszkowe do mapowania aktywności elektrycznej mózgu do celów diagnostycznych (Chang, 2015).

Wewnętrzne właściwości G można wykorzystać do projektowania urządzeń opartych na G dla interfejsów neuronalnych, ponieważ G może poprawić optyczne, elektryczne i mechaniczne właściwości kompozytowych nanostruktur. Ogólnie rzecz biorąc, podstawowe wymagania dla dobrego implantu nerwowego to dobra biokompatybilność w połączeniu z minimalną odpowiedzią zapalną, odpowiedni stosunek sygnału do szumu, jeśli przewiduje się zapisy neuronowe, oraz minimalna inwazyjność, zachowująca integralność wszczepionej tkanki. Zazwyczaj rusztowania na bazie G można sklasyfikować według ich wymiarowości, tj. jednowymiarowe (włókna, wstążki lub przędze), dwuwymiarowe (papiery, filmy) i trójwymiarowe (Cheng i in., 2016; Reina i in., 2017). Najczęstsze zastosowania struktur opartych na G w nanomedycynie obejmują inżynierię rusztowań do regeneracji, stymulacji i rejestracji neuronów in vivo oraz do dostarczania leków na żądanie (Cong i in., 2014; Cheng i in., 2016). Jeśli chodzi o zastosowania in vivo, zastosowanie urządzeń 2D ogranicza się głównie do elektrod płaskich (Liu i in., 2016; Park i in., 2018). W rzeczywistości zaprojektowano kilka urządzeń 2D opartych na G, ale ze względu na ograniczenia techniczne, do tej pory były one testowane głównie in vitro (kompleksowy przegląd substratów 2D G stosowanych w komórkach neuronalnych patrz (Bramini et al., 2018) . Obiecujące wyniki in vitro uzyskali ostatnio Defterali et al. (2016a). Niepowlekane termicznie zredukowane substraty grafenowe (TRG) wykorzystano do wzrostu i różnicowania nerwowych komórek macierzystych (NSC), które rosły bezpośrednio na materiale G bez wcześniejszej powłoki biomolekułowej. Kultury hodowane na podłożach TRG charakteryzowały się wyższą liczbą komórek i większą liczbą butonów synaptycznych, a także wydajnym różnicowaniem wieloliniowym w porównaniu z kulturami hodowanymi na nanorurkach węglowych, co sugeruje potencjalne wykorzystanie G do badania funkcjonalnych sieci neuronalnych. W przypadku CVD-G natomiast etapem ograniczającym jest przeniesienie monowarstwy G na końcowe podłoże, proces, który często tworzy zanieczyszczenia i defekty w strukturze G. Ponadto nadal nie znaleziono odpowiedniego podłoża, które będzie w jak najmniejszym stopniu ingerować w właściwości chemiczno-fizyczne G. Ponadto urządzenia 2D były mniej aktywne in vitro z neuronalnymi komórkami macierzystymi w porównaniu z rusztowaniami 3D o tej samej chemii powierzchni (Jiang i in., 2016), co wyraźnie wskazuje, że morfologia, wymiarowość, dostępność i porowatość są krytycznymi cechami rusztowania. Rzeczywiście, pianki i hydrożele są rusztowaniami z wyboru do napędzania regeneracji w mózgu, podczas gdy kanały kierunkowe są preferowane do napędzania ponownego wzrostu nerwów obwodowych. W następnym akapicie omówimy najnowsze osiągnięcia w zakresie wykorzystania rusztowania 3D G w neurobiologii, koncentrując się na związku między zawartością G a strukturą urządzenia i jego funkcjonalnością.

Rusztowania 3D G: kompozyty, pianki, włókna i hydrożele

Zastosowanie materiałów na bazie G w dziedzinie neurologii będzie możliwe tylko po opracowaniu trójwymiarowych rusztowań zdolnych do wspierania regeneracji nerwów w miejscu uszkodzenia / uszkodzenia. Unikalne właściwości planarnych rusztowań 2D G są przekraczane przez struktury G 3D, które zapewniają mikrośrodowisko, w którym komórki są w stanie rosnąć w warunkach bliższych sytuacji in vivo. Ponadto, jak wcześniej wspomniano, struktury 3D posiadają ogromny obszar interfejsu i zapewniają wysoce przewodzące ścieżki transportu ładunku, przydatne do wspierania tworzenia sieci neuronowych i regeneracji neuronów.

Kilka rusztowań 3D zostało wygenerowanych i przetestowanych in vitro, jednak jak dotąd tylko bardzo ograniczona ich liczba została również wszczepiona in vivo (ryc. 4). Niektóre przykłady obejmują rusztowania z mikrofibry PCL powlekane elektroprzędą, które zostały wszczepione w prążkowie lub strefie podkomorowej dorosłych szczurów. Implanty powlekane G były związane z niższą infiltracją mikrogleju / makrofagów w porównaniu z gołymi rusztowaniami, jednocześnie wspierając astrocyty i migrację neuroblastów z SVZ (Zhou i in., 2016). Wolnostojące porowate rusztowania 3D GO zostały wszczepione w uszkodzony rdzeń kręgowy szczura, nie wykazując toksyczności miejscowej ani ogólnoustrojowej i dobrą biokompatybilność również w przypadku przewlekłej implantacji (López-Dolado i in., 2015). Warto zauważyć, że długoterminowe (30 dni) implanty były w stanie promować angiogenezę i częściową regenerację aksonów (López-Dolado i in., 2016). Do tej pory nie podjęto żadnych prób wykorzystania materiałów na bazie G do regeneracji obwodowego układu nerwowego. Pierwszym krokiem w tym kierunku jest inżynieria kompozytowych membran z nanowłókien fibroinowych G-silk. Ten materiał kompozytowy jest interesujący, ponieważ łączy przewodność elektryczną i wytrzymałość mechaniczną G z dobrą kompatybilnością jedwabiu. Chociaż nie zostały przetestowane in vivo, błony jedwabiu G wspierają wzrost komórek Schwanna in vitro (Zhao i in., 2017).

Wykazano, że różne trójwymiarowe pianki G i GO są kompatybilnymi substratami dla komórek macierzystych (Crowder i in., 2013; Li N. i in., 2013; Serrano i in., 2014; Guo i in., 2016; Sayyar i in., 2016). Li N. et al. (2013) po raz pierwszy opisali pianki na bazie 3D G (3D-GF) jako odpowiednie rusztowanie dla wzrostu i proliferacji NSC. NSC hodowane na 3D-GF były w stanie różnicować się w neurony i astrocyty; co więcej, zauważono również, że 3D-GF są optymalnymi platformami do elektrycznej stymulacji NSC w celu zwiększenia ich różnicowania. Podobne wyniki uzyskano ostatnio z mikrowłóknami rGO, które mogą wspierać żywotność NSC i kierować je w kierunku fenotypu neuronalnego (Guo i in., 2017). Co ciekawe, cechy rusztowań G (tj. sztywne vs. miękkie) w różny sposób wpływały na adhezję i proliferację komórek i mogą napędzać różnicowanie NSC odpowiednio w kierunku linii astrocytów i neuronów (Ma i in., 2016). Neurony hipokampa hodowane na 3D-GF charakteryzują się szerszą łącznością związaną z wyższą synchronizacją sieci w odniesieniu do substratów 2D-G, dzięki czemu lepiej naśladują fizjologiczne właściwości mózgu (Ulloa Severino i in., 2016). Komórki mikrogleju hodowano również na piankach 3D G. W tym przypadku struktura 3D rusztowań wpłynęła na odpowiedź neurozapalną hodowanych komórek, prawdopodobnie z powodu ograniczeń przestrzennych wynikających z cech topograficznych 3D (Song i in., 2014). Podobnie jak w przypadku materiałów 2D, również rusztowania 3D G / GO zostały wykorzystane jako elektrody stymulujące komórki, aby napędzać wzrost neuronów i różnicowanie NSC (Li N. i in., 2013; Akhavan i in., 2016).

Opracowywana jest również nowa generacja elektroreagujących rusztowań 3D-G, tj. hydrożeli na bazie G, które naśladują tkanki miękkie i zostały zaproponowane do kontrolowanych, wyzwalanych stymulacją zastosowań uwalniania leków. Hybrydowe hydrożele na bazie G są syntetyzowane głównie przy użyciu GO, nadtlenku tlenku G (GOP) lub rGO, poprzez włączenie bardzo małych ilości materiału do matrycy hydrożelowej, w celu poprawy jego właściwości elektrycznych, mechanicznych i termicznych (Servant i in., 2014b). Takie materiały są w stanie wspierać wzrost neuronów i rozwój aktywności synaptycznej (Martín i in., 2017). Zgodnie z podobnym podejściem, deksametazon, lek kortykosteroidowy, został załadowany na poli(mlekowo-ko-glikolowe) NP, które następnie dodano do hydrożeli alginianowych. Końcowy kompozyt został użyty jako powłoka elektrod złota i irydu do miejscowego podawania leków po implantacji (Kim et al., 2004; Kim i Martin, 2006). Te lub podobne strategie można zastosować do opracowania inteligentnej powłoki dla implantów neuronalnych, z ostatecznym celem posiadania urządzenia zdolnego do uwalniania biologicznie aktywnych cząsteczek na kontrolowane bodźce elektryczne, jednocześnie poprawiając miękkość powierzchni i zwiększając biokompatybilność implantów.

Ogólnie rzecz biorąc, wykorzystanie materiałów G w implantach 3D przeznaczonych do zastosowań neurologicznych jest nadal ograniczone. Wiele można się jednak nauczyć z innych dziedzin biomedycyny. Na przykład ostatnio zaproponowano G-hydrożele i pianki do terapii przeciwnowotworowej (Xu i in., 2017; Zhang i in., 2017), a także do regeneracji kości kierowanej (Lu i in., 2016), chrząstki (Nieto i in., 2015) i mięśni (Mahmoudifard i in., 2016). Spodziewamy się, że wzajemne inspirowanie między tymi różnymi dyscyplinami doprowadzi w niedalekiej przyszłości do opracowania funkcjonalnych implantów 3D opartych na G do zastosowań układu nerwowego.

Grafenowe urządzenia do rejestracji neuronowej i stymulacji

Interwencje kliniczne mające na celu odzyskanie dysfunkcji nerwowych i zaburzeń motorycznych przyciągają i rzucają wyzwanie badaniom nad wszczepialnymi urządzeniami stymulującymi, które są w stanie dostosować się do elastycznych podpór i być może przewyższyć najbardziej powszechne technologie oparte na elektrodach metalowych. Interfejsy polimerowe przewyższają właściwości zgodne mechanicznie, ale często brakuje im trwałości w warunkach fizjologicznych, a przede wszystkim właściwej przewodności elektrycznej. Większość stymulacji neuronalnej wykonanej do tej pory za pomocą elektrod opartych na G w kontakcie z żywymi tkankami lub komórkami neuronalnymi została ograniczona do modulowania ich wzrostu i / lub różnicowania (Thompson i in., 2015).

Techniki stymulacji neuronowej, takie jak głęboka stymulacja mózgu lub korowa, implanty ślimakowe i siatkówki, zwykle opierają się na zdolności wszczepionych urządzeń do wywoływania funkcjonalnej odpowiedzi tkanki poprzez zapewnienie minimalnego wstrzykniętego ładunku, a zatem wymagają elektrod (Kostarelos i in., 2017). Do tej pory badania in vivo pokazują, że elektrody G mogą stymulować i rejestrować aktywność neuronów. Elektrody G wytwarzają nieco wyższe wartości wtrysku ładunku w stosunku do zwykłych elektrod z metali szlachetnych, takich jak Pt lub Au. Nowe obiecujące materiały i związki wykorzystują G do osiągnięcia nawet dziesiątek mC cm⁻² poziomy wtrysku ładunku, jak w przypadku sondy in vivo laserowo zredukowanego GO osadzonego w parylenu-C (Apollo i in., 2015). Autorzy wykorzystują nowe, elastyczne, wolnostojące elektrody zarówno do stymulacji komórek zwojowych siatkówki ex vivo, jak i do rejestrowania aktywności neuronalnej in vivo z kory wzrokowej kota. Jest to jeden z niewielu zgłoszonych dowodów stymulacji neuronalnej za pomocą urządzenia opartego na G. Inne interesujące zastosowania wykorzystują miedziane mikrodruty zamknięte CVD-G do urządzenia neuronowego kompatybilnego z MRI (Zhao Y. i in., 2016) lub elastyczne mikrotranzystory G do mapowania aktywności mózgu (Blaschke i in., 2016), by wymienić tylko kilka, ale nadal ograniczone do rejestrowania aktywności neuronalnej in vivo. Ponadto Kuzum et al. (2014) opracowali również elastyczną, niskoszumną elektrodę G do jednoczesnej elektrofizjologii i obrazowania in vivo. Po wstrzyknięciu bicukulliny w celu wywołania aktywności padaczkowej możliwe było jednoczesne rejestrowanie z półkul korowych szczura za pomocą elektrod G i elektrod Au tej samej wielkości. Elektrody G wykazały sześciokrotnie niższy stosunek sygnału do szumu w stosunku do elektrod Au, co sugeruje, że przyjęcie nowego systemu rejestracji opartego na G może przynieść wyraźne korzyści w badaniu aktywności elektrycznej mózgu (ryc. 5). Ponadto, dzięki przezroczystości elektrod G, możliwe było również zobrazowanie obszaru kory mózgowej, łącząc obrazowanie dwufotonowe in vivo i korowy zapis elektrofizjologiczny (Kuzum i in., 2014).

Dalszy postęp osiągnięto dzięki opracowaniu tranzystorów polowych G (G-FET), które umożliwiają wzmocnienie sygnału redukujące szum zewnętrzny (Veliev i in., 2017). Elastyczne superkondensatory na bazie G wykazały ostatnio swój potencjał do stymulacji neuronalnej dzięki ulepszonej pojemności dwuwarstwowej po hybrydyzacji z materiałami polimerowymi, takimi jak PEDOT: PSS i rGO, nanokompozyty G-polianiliny lub pianki CVD GO (Yang W. i in., 2015; Hu i in., 2016). Innym sposobem wykorzystania G w zastosowaniach biomedycznych było zwiększenie właściwości optoelektronicznych światłoczułych interfejsów neuronowych przeznaczonych do odzyskiwania upośledzonych widzeń. Poliimidowa matryca fotodetektorów oparta na MoS₂ i atrament G został niedawno zaproponowany jako elastyczna proteza siatkówki i przetestowany pod kątem biokompatybilności in vitro (Hossain i in., 2017). Niemniej jednak większość z tych wysiłków musi jeszcze zostać przełożona na użyteczne elektrody do zastosowań neurologicznych.

Modelowanie obliczeniowe i symulacje układów biomolekularnych oddziałujących z grafenem

Zrozumienie drobnych szczegółów strukturalnych leżących u podstaw interakcji między biomolekułami a powierzchniami nieorganicznymi ma kluczowe znaczenie dla wielu zastosowań w nanomedycynie. Chociaż niedawno zgłoszono istotne wyniki eksperymentalne dotyczące dynamiki tych interakcji, wiele szczegółów topologicznych pozostaje niejasnych, szczególnie w początkowych zdarzeniach w skalach czasowych ns do μs. Aby wypełnić tę lukę, zastosowanie modelowania obliczeniowego i symulacji dynamiki molekularnej (MD) stanowi istotny wkład, dostarczając szczegółów, do których nie można uzyskać dostępu za pomocą technik eksperymentalnych (Ozboyaci i in., 2016).

Dzięki swoim obiecującym właściwościom G wykazał ogromny potencjał w różnych zastosowaniach, a liczba poświęconych mu badań obliczeniowych stale rośnie (Cavallucci i in., 2016). Klasyczne symulacje MD (tj. Oparte na klasycznym opisie fizyki interakcji atom-atom) przyniosły w ostatnich latach dużą ilość wyników dotyczących interakcji między materiałami opartymi na G a biomolekułami. W szczególności badania te pozwoliły głęboko scharakteryzować G jako substrat lub nanopory do osadzania biomolekuł, różnicując zachowanie nieskazitelnego G od zachowania GO. Co więcej, symulacje MD są szeroko stosowane do testowania biokompatybilności G poprzez badanie jej interakcji z różnymi strukturami biologicznymi, takimi jak błony i kompleksy białkowe. W tych badaniach G został opisany jako obiecujący wektor przeciwko czynnikom bakteryjnym, a także materiał zdolny do zakłócania kompleksów biologicznych.

Najważniejszym problemem w klasycznych symulacjach tych systemów, wciąż obecnie przedmiotem debaty, jest zdefiniowanie odpowiedniego zestawu parametrów pól siłowych dla G, aby umożliwić implementację udanych symulacji z głównymi pakietami oprogramowania wykorzystywanymi do symulacji systemów biologicznych, np. GROMACS, (Abraham et al., 2015), CHARMM (Brooks et al., 2009) lub NAMD (Phillips et al., 2005). Chociaż badano różne wybory, powszechnie przyjmuje się opisywanie atomów G jako nienaładowanych sfer Lennarda-Jonesa (Hummer et al., 2001; Patra i in., 2009, 2011). Niedawno opublikowano listę parametrów G stosowanych w różnych polach sił (Pykal i in., 2016). Celem niniejszego akapitu jest podsumowanie głównych wyników badań obliczeniowych dotyczących interakcji między materiałami opartymi na G a biomolekułami, szeroko badanych na poziomie wieloskalowym. Zastosowano wiele różnych podejść, takich jak modele całkowicie atomowe lub gruboziarniste oraz różne parametry do badań interakcji (tak zwane pola siłowe).

Ogólnym problemem w biofizyce obliczeniowej jest luka między wielkością i skalą czasową, które można zbadać za pomocą symulacji, a biologicznie istotnymi mechanizmami. Modelowanie molekularne jest w stanie opisać układy biologiczne ze szczegółami wszystkich atomów, ale ogranicza to jego zastosowanie do badania systemów co najwyżej ~ 150 nm i w skali mikrosekundowej. Możliwym sposobem wypełnienia tej luki jest zastosowanie symulacji gruboziarnistej dynamiki molekularnej (CGMD), które opierają się na kontrolowanej redukcji liczby stopni swobody i wykorzystaniu funkcji oddziałujących na krótszym zasięgu. Ze względu na te uproszczenia symulacja CG ma niewielką rozdzielczość, ale wymaga mniej zasobów obliczeniowych, umożliwiając badanie większych systemów w dłuższych skalach czasowych. Obiecującym podejściem jest zastosowanie opisu wieloskalowego, poprzez naprzemienne stosowanie klasycznych symulacji all-atom z CGMD.

Niedawno opublikowano kilka badań obliczeniowych dotyczących systemów G-biomolekuł, które można pogrupować w następujące obszary tematyczne:

1. Adsorpcja białek i peptydów (ze szczególnym uwzględnieniem enzymów i białek krwi) na substratach G, w kontekście badania architektury funkcjonalnej do zastosowań biomedycznych. Wyniki pokazują, że GO ma dobrą rozpuszczalność w roztworze wodnym i innych rozpuszczalnikach organicznych, dzięki grupom zawierającym tlen, które mogą działać jako miejsca reakcji wiązania różnych cząsteczek. Na przykład immobilizacja enzymów na stałym podłożu jest skutecznym procesem poprawiającym jego aktywność, podczas gdy głównym czynnikiem decydującym o biokompatybilności nanomateriału w kontakcie z krwią, np. implantów medycznych, jest adsorpcja białek na jego powierzchni.

2. Interakcja G z biomembranami w celu oceny bezpieczeństwa biologicznego lub toksyczności G, a także jej obiecująca funkcja jako wektora nowych klas antybiotyków.

3. Wykrywanie DNA lub białka przez nanopory G, zachęcającą klasę nanoczujników, które są mniej wrażliwe niż pory biologiczne na różne czynniki, takie jak temperatura i pH.

W następnym akapicie opisujemy bardziej szczegółowo niektóre badania z punktów 1 i 2 powyżej, podczas gdy dla tych w punkcie 3 odsyłamy zainteresowanego czytelnika do następujących prac dotyczących badania wykrywania DNA (Sathe i in., 2011, 2014; Wells i in., 2012; Qiu i wsp., 2015; Barati Farimani i in., 2017a) oraz za badanie wykrywania białek do Barati Farimani et al. (2017b).

Adsorpcja biomolekuł na grafenie

Nieskazitelne podłoża grafenowe

Jedna z pierwszych prób obejmujących symulacje MD wszystkich atomów w celu zbadania adsorpcji białek na grafenie została opisana w Zuo et al. (2011) , gdzie zastosowano głowicę villin (HP35). Symulacje wykazały szybką adsorpcję HP35 na podłożu, powodując istotne zmiany konformacyjne zarówno w strukturze białka drugorzędowego, jak i trzeciorzędowego. Interakcje układania π/π między resztami aromatycznymi a G dominują w interakcji białko-G, inaczej niż w symulacjach HP35 z zakrzywionymi nanostrukturami węglowymi.

Właściwości G jako substratu do adsorpcji biomolekuł badano w kolejnych latach. Katoch et al. (2012) przeprowadzili symulacje MD w połączeniu z technikami eksperymentalnymi, takimi jak mikroskopia sił atomowych, spektroskopia Ramana i spektroskopia w podczerwieni w celu wyjaśnienia wiązania peptydów z G i grafitem. W tej pracy peptyd dodecamera tworzy złożoną strukturę siatkową po adsorpcji, o spiralnej konformacji różnej od α-helisy. Cheng et al. (2013) zbadali za pomocą symulacji MD interakcję między różnymi peptydami a G. W tych symulacjach płaskie podłoże G ulega zniekształceniu po adsorpcji peptydów. Autorzy wnioskują, że wiele czynników, w tym wielkość peptydu, liczba, dystrybucja i wyrównanie, może wpływać na interakcję z substratem G. Zhou i współpracownicy (Gu i in., 2015) przeprowadzili symulacje MD, aby pokazać, w jaki sposób białka krwi, takie jak fibrynogen bydlęcy (BFG), mogą szybko adsorbować się na powierzchni G. Co istotne, symulacje te opisują, oprócz wspomnianego efektu silnych interakcji π/π układania w stos, inną kluczową interakcję wynikającą z podstawowych pozostałości. Pozostałości te odgrywają istotną rolę podczas procesu ze względu na silne interakcje dyspersyjne między ich łańcuchami bocznymi a podłożem. Globalnie, oddziaływania hydrofobowe, elektrostatyczne i π/π układania w stosy powodują immobilizację cząsteczki na G.

Kim et al. (2015) zbadali rozpoznawanie G przez peptydy w odniesieniu do składu chemicznego G, liczby nałożonych warstw i podstawowego nośnika substratu. Wyniki tej pracy obliczeniowej, wraz z danymi eksperymentalnymi opartymi na rezonansowej spektroskopii Ramana, mikrowadze kwarcowej i pomiarach kąta kontaktu wody, wskazują, że jakość G jest istotnym czynnikiem w interakcjach peptydów G, podczas gdy interakcja wydaje się nie wykazywać znaczącej zależności od liczby warstw G lub podstawowego substratu pomocniczego. Cheng et al. (2013) przeprowadzili symulacje MD między różnymi peptydami fibroiny jedwabiu i G (Cheng et al., 2015) . Praca ta ilustruje, że podczas gdy G konkuruje z wewnątrzcząsteczkowymi interakcjami białek, zmniejszając ich zawartość β arkuszy, zwiększa również stabilność segmentów o rzadkich uporządkowanych strukturach drugorzędowych i słabych interakcjach wewnątrzcząsteczkowych. Globalnie G daje niezwykły wpływ na konformację molekularną tych reprezentatywnych sekwencji.

Ponadto Hughes i Walsh (2015) wykorzystali metody MD z rozszerzonym próbkowaniem do zbadania powiązań między sekwencją a wiązaniem zaadsorbowanych peptydów z G. Po pierwsze, swobodną energię adsorpcji wszystkich 20 naturalnie występujących aminokwasów uzyskano przy użyciu dobrze temperowanej metadynamiki (Barducci et al., 2008), zapewniając w ten sposób punkt odniesienia dla interpretacji badań adsorpcji peptydowo-grafenowej. W tych obliczeniach obserwuje się silne wiązanie dla aminokwasów, które mają płaskie i / lub zwarte łańcuchy boczne. Następnie przeprowadzono wymianę replik z symulacjami odpuszczania substancji rozpuszczonej (Terakawa i in., 2011) w celu pobrania próbki konformacyjnego zespołu dwóch eksperymentalnie scharakteryzowanych peptydów, P1 i jego mutanta alaniny P1A3, w roztworze i zaadsorbowanego na G. Wyniki pokazują, że podczas gdy P1A3 wykazuje głównie nieuporządkowane konformacje, zarówno w roztworze, jak i po adsorbacji, spiralna konformacja P1 jest stabilizowana przez adsorpcję na G poprzez oddziaływanie silnie wiążących reszt.

W 2016 roku Yeo i in. (2016) zbadali mechanizm adsorpcji pojedynczych i wielokrotnych segmentów peptydowych surowicy bydlęcej albuminy (BSA) na G, poprzez analizę szerokiego zestawu parametrów, takich jak przemieszczenie średniej kwadratowej, liczba wiązań wodorowych, zawartość spiralna, energie interakcji i przemieszczenie środka masy peptydu. Autorzy zaobserwowali destabilizację struktur spiralnych w układzie pojedynczego segmentu, ze względu na silne interakcje między peptydem a substratem. Z drugiej strony, lepszą ochronę całkowitej zawartości spiralnej obserwuje się w systemie wielosegmentowym, co oznacza ochronne zbiorowe działanie peptydów. Niedawno No et al. (2017) donieśli o inspirowanym naturą dwuwymiarowym samoorganizacji peptydów na G poprzez optymalizację interakcji peptyd-peptyd i peptyd-G. Symulacje atomowe określiły optymalną sekwencję peptydową, która prowadzi do samoorganizacji peptydów na G, co sugeruje, że optymalna sekwencja peptydowa minimalizuje energię oddziaływania peptyd-G, a także energię oddziaływania peptyd-peptyd, co skutkuje stabilnymi kompleksami na G.

Substraty GO

Adhezja biomolekuł do warstw GO i rGO została zbadana w Chong et al. (2015) w celu przetestowania różnych zalet GO ze względu na obecność atomów tlenu. Interakcje białek surowicy z nanoarkuszami GO badano za pomocą dużego zestawu technik eksperymentalnych i symulacji MD, wykazując wysokie zdolności adsorpcyjne GO i rGO. Należy jednak podkreślić, że podczas gdy GO i rGO zostały użyte w eksperymentach, nieskazitelny G został wybrany do symulacji odpowiednich nieutlenionych regionów powierzchni obecnych na nanoarkuszach GO. Działanie GO zostało dokładniej zbadane poprzez przedstawienie substratu za pomocą modelu Lerfa-Klinowskiego (Lerf et al., 1998), który opisuje zachowanie standardowego procesu utleniania. Stosując to podejście, dwa artykuły paradygmatyczne (Sun et al., 2014; Zeng i wsp., 2016) wykazały, że GO wykazuje zwiększoną adsorpcję dołączonego białka. Po pierwsze, w Sun et al. (2014) przedstawiono atomistyczny opis hamującego działania GO na aktywność α-chymotrypsyny (ChT). Wyniki potwierdzają hipotezę, że GO można uznać za obiecujący receptor hamowania enzymów. Po drugie, Zeng et al. (2016) pokazują szczegóły energii wiązania GO z Vpr13-33, fragmentem białka wirusowego R (Vpr), wykorzystując obliczenia potencjału średniej siły (PMF) z próbkowaniem parasolowym metodą rozszerzoną (Kästner, 2011).

Niedawno Willems et al. (2017) zbadali dynamikę podtrzymywanych plam błony fosfolipidowej stabilizowanych na powierzchniach G. Systemy te wykazują potencjał w funkcjonalizacji urządzeń czujnikowych. Autorzy zintegrowali pomiary eksperymentalne i symulacje CGMD w celu scharakteryzowania właściwości molekularnych obsługiwanych błon lipidowych (SLM) na nośnikach G i GO. Wyniki opisały istotne różnice w topologiach stabilizowanych struktur lipidowych, w zależności od charakteru powierzchni, dostarczając nowych szczegółów na temat molekularnych efektów powierzchni tlenku G i G na błony lipidowe.

Ogólnie rzecz biorąc, równolegle z tą znaczną ilością danych, w tym wyłaniającym się obszarze zastosowań obliczeniowych wiele podstawowych problemów pozostaje nierozwiązanych z powodu braku wystarczających wyników eksperymentalnych. W szczególności szczegółowy rozkład grup zawierających tlen na podłożu jest trudny do określenia, ze znaczną stratą w opisie mechanizmu adsorpcji.

Interakcje grafenu z biomembranami

Interakcja G z kompleksami biomolekularnymi ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jej bezpieczeństwa biologicznego i potencjalnej toksyczności. Przełomowa praca (Tu et al., 2013) wykazała, że nanoarkusze GR i GO indukują degradację wewnętrznych i zewnętrznych błon komórkowych Escherichia Coli. W szczególności symulacje MD wykazały, że G jest w stanie aktywnie ekstrahować cząsteczki fosfolipidów z dwuwarstwy lipidowej, mocując je na swojej powierzchni. Chociaż wyniki te wprowadzają G jako wygodne narzędzie zdolne do zabijania bakterii, istnieje bogata literatura, w której G wykazuje również destrukcyjne zdolności wobec niektórych biomolekuł (Luan i in., 2015).

W tym kontekście wyniki symulacji CGMD opisują zupełnie inny scenariusz. Jedno z pierwszych zastosowań CGMD do badania interakcji G-biomolekuł można znaleźć w Titov et al. (2010) . Tam pole siłowe Martiniego (Marrink et al., 2007) jest wykorzystywane do badania interakcji nanoarkuszy G z dwuwarstwami fosfolipidowymi utworzonymi przez 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (błona POPC). Wyniki pokazały, że arkusze G znajdują się w hydrofobowym wnętrzu membrany, tworząc stabilne struktury G-lipidowe (ryc. 6).

W kolejnych latach inne prace badały te systemy za pomocą różnych algorytmów CGMD, takich jak Guo et al. (2013) , Li Y. et al. (2013) oraz Mao et al. (2014) . We wszystkich tych badaniach nie obserwuje się jednak ekstrakcji lipidów ani uszkodzenia błony, w przeciwieństwie do wyników Tu i in. (2013). Niedawno wykorzystano symulacje obliczeniowe do wyjaśnienia, czy G powoduje uszkodzenie błony komórkowej (Chen J. i in., 2016). Symulacje MD wszystkich atomów wykorzystano do zbadania interakcji zarówno G, jak i GO w odniesieniu do dwuwarstwy dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) i ujawniły, że G szybko wchodzi do błony, przyjmując pozycję równoległą do ogonów lipidowych. I odwrotnie, GO nie dostał się do membrany spontanicznie w obserwowanej skali czasowej, ale po zadokowaniu do dwuwarstwy utworzył pory w membranie.

Szczególnie ważnym systemem biomembranowym jest system zaangażowany w tworzenie barier biologicznych, takich jak na przykład BBB. Badania obliczeniowe mogą być przydatne do zbadania wpływu ekspozycji barierowej na materiały oparte na G (ryc. 6), ale badanie tak złożonych architektur jest nadal utrudnione przez brak informacji strukturalnych (Alberini i in., 2017).

Wnioski: Przyszłe wyzwania i perspektywy

W ciągu ostatnich kilku lat GRM były badane i wykorzystywane w szerokim zakresie dziedzin technologicznych, w tym w zastosowaniach biomedycznych. Leczenie zaburzeń neurologicznych za pomocą nieinwazyjnych metod farmakologicznych jest nadal dużym wyzwaniem. Dla naukowców kluczowe jest opracowanie strategii skutecznego dostarczania ładunków leków lub biomolekuł, a nawet genów do mózgu, z pominięciem BBB przy jednoczesnym zachowaniu jego struktury i funkcji życiowych. Jednym z celów nanomedycyny jest rzeczywiście stworzenie innowacyjnych sposobów celowania w komórki i kontrolowanego uwalniania leków poprzez unikanie operacji lub innych podejść, które są bardzo inwazyjne dla pacjenta. W tym scenariuszu wybór odpowiedniego kompleksu ligand-receptor jest kluczowym elementem projektu przy konstruowaniu nanonośników, a także wyboru materiału, wielkości i ewentualnej funkcjonalizacji. Podczas gdy transcytoza za pośrednictwem receptora jest podstawową ścieżką krzyżowania BBB, rozwój nanonośników nowej generacji, takich jak materiały 2D, oraz badanie i optymalizacja alternatywnych dróg dostarczania, takich jak podawanie donosowe, ma ogromne znaczenie dla społeczności naukowej.

Oprócz "wyzwania BBB", inne aspekty neuronauki mogą skorzystać z najnowszych osiągnięć w badaniach nad grafenem. Neuroonkologia może skorzystać z rozwoju nanoarkuszy G i G NP do obrazowania ukierunkowanego na guz, terapii fototermicznej oraz dostarczania leków przeciwnowotworowych i terapii genowej. Nowe czujniki elektryczne, chemiczne i optyczne mogą mieć ogromny wpływ na intensywną terapię neurologiczną i neuromonitoring. Co więcej, połączenie różnych form i stanów G, zróżnicowana funkcjonalizacja chemiczna i możliwe powiązanie z innymi biomateriałami w celu utworzenia kompozytów na bazie G może pozwolić na opracowanie kompleksowego narzędzia zarówno do diagnostyki, jak i terapii, skutecznie budując w ten sposób potężne urządzenie teranostyczne.

Wreszcie, oczekuje się, że badania inżynierii tkankowej opracują nowe interfejsy mózg-implant oparte na G, aby wykorzystać przewodność elektryczną materiału i poprawić komunikację i naprawę komórka-komórka. Oprócz dowodów eksperymentalnych i klinicznych, badania MD stają się ważnym aspektem badań materiałowych, ponieważ dostarczają niezwykle precyzyjnych wskazań i przewidywań dotyczących interakcji G / komórki i G / białka, prowadząc badacza do projektowania mocniejszych urządzeń opartych na G.

Niemniej jednak, pomimo początkowych badań wykazujących biokompatybilność G, zwłaszcza w połączeniu z innymi materiałami w rusztowaniach 2D i 3D, wykazano tylko kilka systemów in vivo. Nadal potrzebne są dalsze badania, w szczególności dotyczące biologicznych skutków długotrwałego leczenia materiałami G, zanim obiecane zastosowania technologiczne będą mogły być w pełni wykorzystane w neuronauce i poza nią.

Wkład autora

MB, FC i FB wymyśliły, ustrukturyzowały i napisały recenzję. Wszyscy autorzy uczestniczyli w pisaniu recenzji, a konkretnie MC przyczynił się do sekcji Wprowadzenie. EC, MLD i JFM-V przyczyniły się do sekcji zapisu i stymulacji neuronów. GA i LM przyczyniły się do powstania sekcji dynamiki molekularnej i modelowania.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczają, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają wsparcie finansowe z unijnego programu badań naukowych i innowacji H2020 w ramach umowy o grant nr 696656 (Graphene Flaghship – Core1).

Odwołania